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TLR4通路誘導上皮間質(zhì)轉化在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種以肝內(nèi)膽管上皮細胞損傷為主要特征的慢性、自身免疫性、膽汁淤積性肝病。該病以中老年女性多發(fā),病因和發(fā)病機制尚不完全清楚。大量證據(jù)表明,PBC是以遺傳為基礎,由遺傳和環(huán)境相互作用而產(chǎn)生的。一些臨床和流行病學研究提示,泌尿道感染等因素可能與PBC的發(fā)病密切相關,是PBC發(fā)病的危險因素,但現(xiàn)有的研究結果并不完全一致,甚至個別研究的結果截然相反。因此,關于泌尿道

2、感染與PBC的關系有待進一步確認。
   毫無疑問,大多數(shù)PBC最終會發(fā)展成為肝纖維化和肝硬化,但能否進展成為肝癌,或者說PBC患者肝癌的患病風險是否較一般人群顯著升高尚存在很大爭議。其原因主要是個體研究的方法學、樣本數(shù)量、統(tǒng)計效能等問題。循證醫(yī)學研究可以對當前的所有相關研究進行系統(tǒng)評價和薈萃分析,研究結果可以為臨床提供最高層次和最具可信性的證據(jù)。但是,到目前為止,關于PBC與肝癌的相關性尚沒有進行循證醫(yī)學研究。
  

3、如果能夠證實泌尿道感染是PBC的一個病因,而PBC又是發(fā)生肝癌的高危因素,那么感染在PBC向肝硬化、肝癌發(fā)展過程中的具體作用機制就是一個急需解決的問題。有研究提示,PBC患者肝內(nèi)膽管上皮細胞(intrahepatic biliary epithelialcells,IBECs) TLR4表達明顯上調(diào),可能參與PBC的發(fā)病。泌尿道感染主要是革蘭陰性細菌,其主要成分為脂多糖(LPS)。因此,我們有理由推測,LPS-TLR4通路在PBC向肝硬

4、化、肝癌發(fā)展過程中具有重要作用。
   為進一步證實以上推測,我們進行了下面的研究:一、通過循證醫(yī)學手段證實泌尿道感染與PBC的關系;二、通過循證醫(yī)學手段證實PBC是肝癌的一個高危因素;三、從臨床水平探討TLR4與EMT(該過程是PBC向肝纖維化、硬化發(fā)展的一個重要步驟)的相關性及在PBC中的意義;四、探討LPS-TLR4通路對IBEC發(fā)生EMT的誘導作用及其具體機制。
   第一部分原發(fā)性膽汁性肝硬化危險因素的循證醫(yī)學

5、研究
   我們主要通過PUBMED、EMBASE、Cochrane圖書館和中國各種醫(yī)學搜索數(shù)據(jù)庫進行文獻檢索,按照以下標準納入相關文獻:(1)報告了相對危險度RR和OR,并且提供了95%可信區(qū)間的觀察性研究;(2)病例對照研究和隊列研究;(3)獨立的研究,沒有重復報告相同人群。應用隨機或固定效應模型進行薈萃分析,探討各種危險因素與PBC的相關性。
   經(jīng)過篩查鑒定,我們納入5篇相關的文獻進行系統(tǒng)評價和薈萃分析。5篇文

6、獻均為英文文獻,包含1913例PBC患者和4697例健康對照。5項研究均涉及吸煙與PBC的相關性,4項研究涉及泌尿道感染與PBC的相關性,3項研究涉及家族史和甲狀腺疾病與PBC的相關性,2項研究涉及飲酒、染發(fā)、扁桃體切除手術、懷孕年齡、激素治療、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎和濕疹與PBC的相關性。薈萃分析結果顯示,泌尿道感染、吸煙和家族史與PBC的發(fā)生密切相關,泌尿道感染患者患PBC的危險度OR=2.02(95%CI:1.4-2.65);吸煙

7、患PBC的危險度OR=1.67(95%CI:1.41-1.92);具有PBC家族史人群患PBC的危險度OR=7.56(95%CI:1.9-13.22)。而甲狀腺疾病與PBC的發(fā)病沒有顯著相關性OR=3.08(95%CI:0.84-5.32)。為進一步確認研究結果的穩(wěn)定性,我們對納入的研究進行了出版偏倚評價。Egger檢驗和Begger's funnel圖分析結果均表明,納入的研究不存在出版偏倚,提示研究結果還是比較穩(wěn)定的。這部分研究結果

8、提示,泌尿道感染是PBC的一個重要病因。
   第二部分原發(fā)性膽汁性肝硬化與肝癌相關性的循證醫(yī)學研究
   為探討PBC與肝癌的關系,證實PBC是肝癌的一個重要危險因素,我們在本部分應用系統(tǒng)評價和薈萃分析的方法探討了PBC與肝癌的相關性。我們主要通過PUBMED、EMBASE和Cochrane圖書館進行文獻檢索,按照以下標準納入相關文獻:(1)隊列研究或病例對照研究;(2)將PBC作為一個暴露因素的研究;(3)將腫瘤作為

9、一個結果的研究;(4)給出RR值及其95%可信區(qū)間或能夠計算出二者的相關數(shù)據(jù)的研究;(5)獨立的沒有重復的研究。如果多個研究報道相同人群或部分相同人群,我們僅納入最新或數(shù)據(jù)最全的研究。
   我們從3510篇文獻中篩選、納入16篇文獻,包括17個個體研究,其中有一篇文獻報告了兩組隊列研究,一組是西班牙人群,另一組是意大利人群。我們對17個個體研究進行了系統(tǒng)評價和薈萃分析。這17個個體研究共包含16368名PBC患者。9個研究報告

10、了PBC與所有腫瘤的危險關系;12個研究報告了PBC與肝癌危險的關系,9個研究報告了PBC與乳腺癌危險的關系;5個研究報告了與腎癌危險的關系;5個研究報告了與結腸癌危險的關系。結果顯示,與一般人群相比,PBC患者患所有腫瘤的相對危險度RR值為1.55(95%CI:1.28-1.83),即PBC患者患所有腫瘤的危險比一般人群要高55%。PBC患者患肝癌的危險度RR值為18.8(95%CI:10.81-26.79),即PBC患者患肝癌的風險

11、比一般健康人群高17.8倍。通過亞組分析,我們發(fā)現(xiàn)在各個亞組PBC均可以顯著增高肝癌的患病風險。只有兩個亞組例外,分別是美國人群和以人群為基礎的研究。雖然在這兩個亞組中,PBC患者患肝癌的風險仍然是一般人群的8倍以上(美國人群是23.88倍,以人群為基礎的研究是8.61倍),但統(tǒng)計學差異并不顯著,這種情況的出現(xiàn)可能主要是因為這兩個亞組所包含的研究數(shù)量太少(均為3篇),而且異質(zhì)性很高,缺少統(tǒng)計效能。此外,與其他腫瘤發(fā)病危險性的薈萃分析結果

12、顯示,PBC與乳腺癌、腎癌等腫瘤的發(fā)生無明顯相關性,對乳腺癌進行亞組分析的結果顯示在各亞組中,PBC均與乳腺癌的發(fā)生沒有密切關系。
   這部分研究結果表明,PBC與肝癌的發(fā)生密切相關,是肝癌發(fā)生的一個高危因素。由于肝纖維化和肝硬化是肝癌的重要原因,而上皮間質(zhì)轉化在纖維化疾病中具有重要作用。結合第一部分的研究,LPS-TLR4通路異?;罨欠裾T導肝內(nèi)膽管上皮細胞間質(zhì)轉化?其具體機制如何?我們將在第三、四部分進行探討。
  

13、 第三部分TLR4及上皮間質(zhì)轉化相關蛋白在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的表達及臨床意義
   為進一步探討TLR4和肝內(nèi)膽管上皮細胞EMT與PBC向纖維化進展的關系以及二者在PBC進展過程中的關聯(lián),我們在本部分研究中應用免疫組化的方法從臨床水平檢測了TLR4及EMT相關蛋白在PBC患者肝組織門管區(qū)膽管上皮細胞的表達。我們收集PBC患者肝穿和肝活檢標本共11例,其中病理1期2例,2期3例,3期2例,4期4例,同時收集5例供肝者肝組織切

14、片標本作為正常對照。采用免疫組化的方法檢測各組細胞角蛋白CK19、TLR4、E-鈣粘蛋白及波形蛋白的表達水平,結果顯示CK19在正常人及PBC患者膽管上皮細胞中均有表達,且陽性率隨著PBC分期增高而明顯降低。TLR4和波形蛋白在正常人肝內(nèi)膽管上皮細胞幾乎無表達,1期PBC患者陽性表達率分別為28.6%和30.0%,2期患者平均陽性率為41.6%和40.1%,3期患者平均陽性率為64%和73.7%,4期患者平均陽性率為73.1%和77.0

15、%。兩兩比較的結果顯示,除1,2期及3,4期外,其余各組間陽性細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。E-鈣粘蛋白在正常人肝內(nèi)膽管上皮細胞表達,而在PBC患者表達明顯降低,1期PBC患者E-鈣粘蛋白平均陽性率為84%,2期患者平均陽性率為48.1%,3期患者平均陽性率為23%,4期患者平均陽性率為19%。兩兩比較的結果顯示,除正常對照與1期以及3,4期外,其余各組間陽性細胞數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。此外,PBC患者TL

16、R4陽性表達率與E-鈣粘蛋白陽性表達率呈負相關(相關系數(shù)rs=-0.927,P<0.01),TLR4與波形蛋白陽性表達率呈正相關(相關系數(shù)rs=0.918,P<0.01),波形蛋白與E-鈣粘蛋白陽性表達率呈負相關(相關系數(shù)rs=-0.918,P<0.01)。
   因此,PBC患者肝組織門管區(qū)肝內(nèi)膽管上皮細胞TLR4的表達明顯增高,而且按照PBC的組織學分期,TLR4隨著PBC纖維化嚴重程度的加深而表達增強。同時,我們發(fā)現(xiàn)PBC

17、患者肝組織門管區(qū)肝內(nèi)膽管上皮細胞E-鈣粘蛋白表達明顯降低、波形蛋白表達明顯增高,這種變化也是隨著PBC纖維化嚴重程度的加重而更加明顯,提示在PBC向纖維化方向發(fā)展的過程中會出現(xiàn)肝內(nèi)膽管上皮細胞EMT現(xiàn)象,且與TLR4表達密切相關。
   那么,在PBC的進展過程中,TLR4對肝內(nèi)膽管上皮細胞EMT是否具有誘導作用及其具體機制,我們將在第四部分通過體外培養(yǎng)肝內(nèi)膽管上皮細胞進行深入探討。
   第四部分TLR4通路對肝內(nèi)膽管

18、上皮細胞EMT的作用機制
   為進一步闡明TLR4通路異?;罨赑BC進展過程中作用機制,我們擬在本部分研究中體外培養(yǎng)肝內(nèi)膽管上皮細胞,利用刮痕實驗、趨化實驗、細胞免疫化學、實時熒光定量PCR、MyD88及Snail小干擾RNA、抑制劑阻斷、Western blot、螢光素酶報告等實驗方法深入探討LPS—TLR4信號通路活化對肝內(nèi)膽管上皮細胞EMT的誘導作用及其具體分子機制。結果顯示10ug/ml LPS刺激肝內(nèi)膽管上皮細胞2

19、4小時后,細胞遷移明顯高于對照組,經(jīng)過Transwell小室遷移的細胞數(shù)為110.4±9.17,明顯高于對照組(75.8±7.78),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。RT-PCR結果顯示,10ug/ml,50ug/ml及100ug/ml LPS作用24小時,與對照組比較,E-鈣粘蛋白基因表達明顯降低,S100A4基因表達明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),細胞免疫化學結果顯示10ug/ml LPS作用24小時,E-鈣粘蛋白表

20、達明顯降低,S100A4蛋白表達明顯升高。轉染MyD88 SiRNA后,經(jīng)10ug/ml LPS刺激24h,刮痕實驗顯示細胞遷移相對距離明顯低于單獨LPS刺激組,Transwell小室實驗結果顯示遷移細胞數(shù)為85.6±8.97,明顯低于LPS刺激組,且轉染MyD88 SiRNA組與單獨加入LPS組比較,E-鈣粘蛋白基因和蛋白表達明顯升高,S100A4基因和蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
   應用抑制劑PD

21、TC、SB203580及SP600125預刺激后加入10ug/ml LPS刺激24小時,與單獨加入LPS組比較,E-鈣粘蛋白基因表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);抑制劑SB203580預刺激后,S100A4及Snail基因表達比單獨加LPS組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),各組Slug基因表達無明顯變化。
   經(jīng)10ug/ml LPS刺激24小時后,轉染Snail SiRNA組E-鈣粘蛋白基因表達比未

22、轉染組明顯增高,S100A4基因表達比未轉染組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。螢光素酶報告實驗結果顯示10ug/ml LPS刺激轉染野生型載體的肝內(nèi)膽管上皮細胞,相對螢光值比對照組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),加入AP-1抑制劑100uM6-姜酚后,相對螢光值明顯降低,而轉染突變型載體組差異無明顯變化。
   通過本部分研究,可以推測LPS通過TLR4-MyD88-P38-AP1-Snail的途徑誘導肝

23、內(nèi)膽管上皮細胞發(fā)生EMT,為PBC向纖維化、硬化發(fā)展的機理提供了一種可能的解釋,為進一步探討如何逆轉PBC向纖維化方向發(fā)展提供一種可能的潛在靶點。
   綜上所述,通過以上四部分的研究,我們初步提出PBC發(fā)生發(fā)展的一個可能機制,即:泌尿道感染-LPS-TLR4通路異?;罨?肝內(nèi)膽管上皮細胞EMT-肝纖維化、硬化-肝癌。這對于有效預防或避免PBC的危險因素,尋找治療PBC的潛在靶點,實現(xiàn)對PBC的合理預防、有效治療或病情逆轉具有重

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