miR-302e在原發(fā)性膽汁性肝硬化固有免疫中的作用.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)是一種病因未明的慢性進(jìn)行性膽汁淤積性肝臟疾病。其病理改變主要以肝內(nèi)細(xì)小膽管的慢性非化膿性破壞、匯管區(qū)炎癥、慢性膽汁淤積、肝纖維化為特征，最終發(fā)展為肝硬化和肝衰竭。多見于中年女性，男女比例約為1:9。PBC是一種典型的自身免疫性疾病，其細(xì)胞免疫及體液免疫均發(fā)生異常反應(yīng)。抗原特異性T細(xì)胞與自身抗原、病原體之間發(fā)生了交叉反應(yīng)使T細(xì)胞打破自身免疫耐受，激活的CD4及CD

2、8T淋巴細(xì)胞持續(xù)傷害膽小管，肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，使其對(duì)激活的T淋巴細(xì)胞敏感性增強(qiáng)，加重了免疫介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。PBC患者主要的診斷指標(biāo)是抗線粒體抗體陽性。PBC患者目前無特效治療，主要就是針對(duì)癥狀的支持治療，熊去氧膽酸是PBC的主要治療藥物。但該藥只對(duì)部分患者有效，且只能延遲疾病進(jìn)展。最終患者仍需選擇肝移植治療，但目前肝移植在我國(guó)開展仍不廣泛，許多患者都得不到有效治療，因此開發(fā)新的治療方案顯得尤為重要。
　　 固有免疫系統(tǒng)是抵抗

3、病原體感染的第一道防線，單核細(xì)胞則是固有免疫系統(tǒng)的重要力量，其表面存在可識(shí)別微生物相關(guān)分子模式(PAMP)的受體(PRR)。Toll樣受體就是PRR的一種類型。膽管內(nèi)皮細(xì)胞就是通過PRR來識(shí)別PAMP。有文獻(xiàn)報(bào)道，固有免疫異常是PBC的重要發(fā)病特征，而PBC患者單核細(xì)胞功能亢進(jìn)也是眾所周知的。說明固有免疫可能參與PBC的發(fā)病，但具體機(jī)制仍需深入研究。
　　 microRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)目的基因的

4、表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的非編碼RNA。與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合后，miRNA可以直接抑制其翻譯或者將其降解。研究表明，在機(jī)體的發(fā)育、腫瘤的產(chǎn)生、細(xì)胞的凋亡等眾多生理或者病理過程中，microRNA都發(fā)揮著極為重要的調(diào)控作用。近年來，microRNA的免疫調(diào)控功能日漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，基礎(chǔ)免疫學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)：microRNA是調(diào)控免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化以及免疫應(yīng)答過程的重要因子；臨床免疫學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫性疾病的發(fā)病

5、機(jī)制與microRNA密切相關(guān)。
　　 基于以上情況，本課題擬通過測(cè)定PBC患者外周血T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞中miR-302e表達(dá)情況，測(cè)定其生物學(xué)功能，并找到miR-302e靶基因，初步了解miR-302e在PBC固有免疫中的作用，從而為PBC的免疫學(xué)治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 第一部分，PBC患者各細(xì)胞亞群內(nèi)miR-302e的相對(duì)表達(dá)水平
　　 最近的研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者肝臟內(nèi)有多個(gè)microRNh表

6、達(dá)異常，提示microRNA參與了PBC的發(fā)病機(jī)制。本部分根據(jù)前期miRNA芯片表達(dá)譜篩選結(jié)果，選擇了降幅比較明顯的miR-302e，我們使用熒光定量PCR方法檢測(cè)PBC患者及健康對(duì)照者PBMC中miR-302e表達(dá)量，使用磁珠分選，流式細(xì)胞術(shù)等方法分選了PBMC中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，使用熒光定量PCR方法檢測(cè)三系細(xì)胞中miR-302e及miR-302a表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBC患者PBMC中miR-302e的表達(dá)約為健康個(gè)體

7、的30％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。PBC患者B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)miR-302e的表達(dá)均較健康個(gè)體顯著降低，其中尤以單核細(xì)胞內(nèi)miR-302e的差異最為顯著(P值均小于0.001)。作為對(duì)照，我們還同時(shí)檢測(cè)了上述細(xì)胞亞群中miR-302a的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PBC患者B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)miR-302a的表達(dá)與健康對(duì)照個(gè)體之間的差異并不顯著(P值均大于0.05)。
　　 本部分研究說明PBC患者PBM

8、C中miR-302e表達(dá)量較健康對(duì)照明顯降低，并在單核細(xì)胞中表達(dá)最為明顯。說明單核細(xì)胞內(nèi)miR-302e表達(dá)下調(diào)在是PBC發(fā)病的重要特征。
　　 第二部分，miR-302e負(fù)向調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放炎癥因子的能力
　　 在本部分研究中，我們通過改變特定免疫細(xì)胞內(nèi)miRNA-302e的表達(dá)來分析其對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。我們選用THP-1細(xì)胞，將miR-302emimics、inhibitor、control轉(zhuǎn)染入

9、THP-1細(xì)胞，以LPS刺激，使用熒光定量PCR，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)等發(fā)放檢測(cè)IL-6及TNF-α的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)miR-302e的豐度發(fā)生了顯著的變化(P值均小于0.01)。以100ng/mlL2S刺激THP-1細(xì)胞可以顯著誘導(dǎo)IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，而miR-302emimics和miR-302einhibitor則分別可以顯著抑制和促進(jìn)炎癥因子IL-6和TNF-α的產(chǎn)生(P值均小于0.01)。
　　

10、本部分研究說明miR-302e可以負(fù)向調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后釋放炎癥因子的能力。提示miR-302e可以負(fù)向調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答的因素，可能是PBC發(fā)病機(jī)制中的重要因子，具有潛在的治療價(jià)值。
　　 第三部分，PBC患者單核細(xì)胞對(duì)LPS刺激呈現(xiàn)高反應(yīng)性
　　 本部分我們使用LPS刺激PBC患者及健康對(duì)照者單核細(xì)胞，以熒光定量PCR及ELISA技術(shù)來檢測(cè)炎癥因子表達(dá)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后，PBC患者單核細(xì)胞IL

11、-6及TNF-α水平明顯高于經(jīng)LPS刺激的健康對(duì)照組單核細(xì)胞(P值均小于0.001)。
　　 這些結(jié)果表明PBC患者的單核細(xì)胞對(duì)LPS刺激呈現(xiàn)出高反應(yīng)性。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者單核細(xì)胞miR-302e表達(dá)下調(diào)，且這種表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致PBC患者單核細(xì)胞表現(xiàn)出明顯“促炎”特性的原因之一。因此，miR-302e可能是PBC潛在的治療靶點(diǎn)。
　　 第四部分，IRAK4是miR-302e的靶點(diǎn)
　　 前面的研究表

12、明PBC可誘導(dǎo)miR-302e表達(dá)降低以及TNF-α和IL-6表達(dá)升高。并且miR-302e可負(fù)向調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞釋放炎癥因子的能力。為進(jìn)一步研究miR-302e調(diào)控TNF-α和IL-6表達(dá)機(jī)制是否是通過TLR4途徑完成的，在本部分的研究中，我們采用了TargetScan軟件預(yù)測(cè)了miR-302e的靶基因，發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路中重要因子IRAK-4是miR-302e的靶基因，隨后，我們采用報(bào)告基因，熒光定量PCR，weste

13、rn等技術(shù)，進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　 檢測(cè)結(jié)果說明：IRAK4是miR-302e的靶基因，miR-302e可負(fù)向調(diào)節(jié)IRAK4的表達(dá)量，miR-302e通過IRAK4調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)通路可能是造成PBC患者單核細(xì)胞功能異常的原因。
　　 第五部分，siRNA沉默單核細(xì)胞IRAK4的表達(dá)可減弱LPS刺激導(dǎo)致的炎癥因子的表達(dá)
　　 在前面的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)miR-302e可以負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，而且發(fā)現(xiàn)miR-302e的調(diào)節(jié)作

14、用正是PBC單核細(xì)胞功能亢進(jìn)的原因，在第四部分中，我們證明了IRAK4是miR-302e的靶基因，但是miR-302e調(diào)節(jié)單核細(xì)胞對(duì)LPS反應(yīng)性是否是通過IRAK4起作用目前尚不明確。在本部分研究中，我們采用siRNA技術(shù)沉默THP-1細(xì)胞上的IRAK4，通過熒光定量PCR及ELISA等方法檢測(cè)沉默IRAK4后，炎癥因子的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染IRAK4siRNA后，加LPS刺激THP-1細(xì)胞，于12小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)量，