SOCS在原發(fā)性膽汁性肝硬化發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種慢性炎癥性、進行性肘內膽汁淤積性自身免疫性肝病，以血清中出現(xiàn)抗線粒體抗體(antimitochondrialantibody，AMA)和導致膽汁淤積性肝硬變的肝臟門脈周圍淋巴細胞浸潤、小膽管特異性破壞為特征，最終發(fā)展成肝硬化和肝衰竭。PBC的病因和確切發(fā)病機制至今尚不完全清楚，可能與遺傳因素、病毒和細菌感染、自身免疫狀態(tài)及環(huán)境因素等有關。可能的發(fā)病機理

2、是：機體對自身抗原的耐受性被打破，致使肝內中、小膽管上皮細胞不斷受到免疫系統(tǒng)的攻擊而引起膽汁淤積最終發(fā)病。但是，誘發(fā)自身免疫應答的始動兇素和自身免疫耐受破壞的機制尚不清楚。 在過去的十幾年里，對PBC的細胞免疫研究主要在外周血不同T細胞亞群，如Th1、Th17和CTL的研究。而對免疫耐受起關鍵作用的樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的功能研究非常少，可能是受到DC標本來源以及培養(yǎng)技術的限制。DC是目前所知的機體內功

3、能最強的抗原遞呈細胞，它不僅是機體免疫應答的始動者，而且在誘導免疫耐受、調節(jié)T細胞介導的免疫應答方面都發(fā)揮著關鍵的作用。 JAK-STAT途徑是一條多種細胞因子共用的信號傳導途徑，在很多慢炎癥性疾病特別是有自身免疫因素參與的疾病中發(fā)揮重要的作用。細胞因子信號轉導抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)是由細胞因子誘導產生的，在JAK-STAT信號和Toll樣受體(toll like

4、 receptor，TLR)通路中重要的負調控蛋白，可以避免機體的過度免疫反應。 SOCS可以負調控巨噬細胞和樹突狀細胞的激活，并參與T細胞的分化和免疫調控等活動，是機體免疫調控系統(tǒng)的重要組成成份。SOCS1是DC介導的T細胞激活和保持免疫耐受的必須的負調控蛋白。目前通過動物實驗已經(jīng)證實SOCS可以治療許多有細胞因子信號通路參與的感染性和免疫性疾病，推測SOCS對自身免疫性疾病的治療具有一定的作用。 迄今為止，JAK-

5、STAT-SOCS通路在PBC發(fā)病過程中的作用缺乏研究，細胞因予的變化與SOCS的負調控作用是否有關?PBC病人中DC的功能研究也非常少，那么PBC免疫耐受的破壞是否與SOCS介導的DC功能變化有關? 基于以上國內外的研究現(xiàn)狀和存在問題，本課題擬通過測定PBC病人血清中炎性細胞兇子的變化，外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)SOCS的變化，并利用PBMCs誘導和培養(yǎng)

6、樹突狀細胞，觀察SOCS對DC功能的影響，來進一步研究SOCS在PBC發(fā)病機制中的作用，從而為PBC的免疫學治療提供一個新的靶點。 第一部分原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清學中炎性細胞因子的變化 機體免疫系統(tǒng)的自身調節(jié)網(wǎng)絡依賴于促炎細胞因子和抗炎細胞因子的平衡，當這種平衡被打破，就會引起自身免疫現(xiàn)象，檢測細胞因子的變化可以反映機體的炎性狀態(tài)和免疫狀態(tài)。研究對象為78例PBC病人，30例慢性乙肝病人(chronic hepati

7、tis Bvirus，CHB)和60例健康對照者(healthy control，HC)。ELISA檢測促炎細胞因子[IL-6，IL-17，Interferon-gamma(IFN-γ)]和抗炎細胞因子(IL-10，TGF-β)，免疫比濁法檢測CRP的變化。 第二部分 PBC患者外周血中TLR和SOCS的表達 TLRs通路活化可以誘導某些細胞因子的產生增加，不僅能誘導自身免疫，而且能調節(jié)免疫耐受。SOCS1和SOCS3

8、是調節(jié)細胞因子和ITLR通路中最重要的兩個因子。小部分主要檢測外周血中TLR和SOCS的mRNA水平以及SOCS的蛋白水平，來研究SOCS在PBC外周血中的變化。 1、PBC患者PBMCs中TLR和SOCS mRNA水平的表達 外周血分離PBMCs，抽提細胞總RNA，建立RT-PCR方法，測定了32例PBC，30例CHB和32例HC組PBMCs的TLR4、TLR9、SOCS1、SOCS3的表達。結果發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，P

9、BC病人的TLR4、TLR9、SOCS1和SOCS3 mRNA的水平均顯著性高于HC，為HC組的1.48、2.51、3.43和1.48倍(P＜0.05)，TLR9和SOCS1的mRNA水平是CHB的6.85倍和2.99倍(P＜0.05)。 2、PBC患者PBMCs中SOCS在蛋白水平的表達 利用Western-blot方法檢測PBC患者和健康對照者PBMCs中SOCS1和SOCS3在蛋白水平上的表達，結果顯示，SOCS1

10、和SOCS3在PBC患者PBMCs中表達明顯高于健康塒照者。 上述發(fā)現(xiàn)證實了TLR-SOCS通路在自身免疫性疾病中的作用，本實驗中TLR4和TLR9在PBC病人中的顯著升高說明TLR過度激活，這與PBC的發(fā)生可能有一定關系，而SOCS作為多條信號通路中的負調控因子，雖然表達也升高，但不能完全抑制細胞因子和HTLR通路的過度激活作用，推測SOCS在PBC發(fā)病過程中的負反饋效應發(fā)揮的不夠。 第三部分 PBC患者外周血來源的D

11、C中SOCS的表達及其作用 我們前兩部分的研究表明PBC病人處于慢性炎性狀態(tài)，SOCS在外周血中表達升高，并不能完全抑制細胞因子和TLR通路的過度激活作用。既然SOCS在DC中高表達，那么SOCS是否會引起PBC病人的DC的功能變化從而誘導免疫耐受的變化?基于這些疑問，我們通過10例PBC的病人，8例HC，PBMCs誘導和培養(yǎng)DC，觀察SOCS在PBC病人DC中的變化，以及DC的表型和分泌細胞因子的變化，來闡述SOCS在PBC發(fā)

12、病機制中的作用。 1、流式細胞術(flow eytometry，F(xiàn)CM)分析DC表型 用FCM分析PBC病人DC的細胞表型，結果顯示CD83，CD86和HLA-DR的表達率分別為：(79.4±4.8)％，(86.5±6.3)％和(90±3.5)％，與HC組的表達率[(68.3±4.1)％，(74.2±6.3)％和(83.6±7.6)％]相比，三者均顯著性升高(P＜0.05)。 2、ELISA檢測DC培養(yǎng)上清中細胞

13、因子含量的變化 PBC病人的DC分泌的細胞因子IL-10，IL-12和IFN-γ分別為：(7.0±4.6)pg/ml，(53.5±11.1)pg/ml和(32.0±9.0)pg/ml，與HC組[(5.8±4.2)pg/ml，(32.1±10.7)pg/ml和(15.4±8.1)pg/ml)]相比，IL-12和IFN-γ顯著性升高(P＜0.05)，而IL-10在兩組之間無顯著性差別(P＞0.05)。 3、Western

14、blot測定DC中SOCS1和SOCS3的變化 本部分研究說明PBC患者體內DC可能更傾向于成熟狀態(tài)，通過DC表面CD86等協(xié)同刺激分子的差異表達，使抗原遞呈能力明顯增強，IL-12和IFN-γ的分泌增加更容易誘導Th1細胞的活化，使機體內免疫反應產生過度，導致了機體內免疫平衡的紊亂和免疫耐受的破壞，從而誘發(fā)了自身免疫性疾病。 第四部分線粒體M2蛋白通過SOCS1通路對DC的作用 PBC的主要免疫學指標是AMA

15、陽性，其血清陽性率可達90％以上，而抗M2亞型抗體是PBC的特異性抗體。我們在第三部分發(fā)現(xiàn)PBC外周血來源的DC中SOCS的表達降低，與外周血的升高不一致，那么SOCS在PBC發(fā)病過程中通過何種途徑發(fā)揮作用?以及線粒體M2蛋白是否會通過活化JAK-STAT-SOCS途徑，并激活DC，從而參與T細胞的激活和細胞因子的分泌?為回答這些疑問，我們在體外誘導和培養(yǎng)健康獻血者外周血全白細胞來源的DC，利用SOCS1的RNA干擾實驗，并在M2蛋白刺

16、激下，模擬PBC的發(fā)病情況，探討SOCS1對DC功能的影響。 1、SOCS1 SiRNA的轉染和抑制效率 利用熒光染料FAM標記的陰性對照可以判斷SiRNA轉染效率。轉染6h后，通過熒光顯微鏡和流式細胞術檢測，SiRNA的轉染效率很高，可以達到95％左右，說明轉染成功。用RT-PCR檢測其抑制效率，發(fā)現(xiàn)SOCS1-156抑制效率最高，在mRNA水平以抑制85％。 2、FCM測定DC表面CD83和CD86的表達

17、 3、ELISA測定DC培養(yǎng)上清IL-12和IL-10的變化 4、western blot檢測DC中SoCS和STAT的變化 本研究我們從負調控的角度首次研究了SOCS在PBC發(fā)病機制中的作用，初步認為SOCS在外周血的表達升高是由細胞因子和TLR激活引起的被動性升高，但其升高并不能完全抑制機體的過度免疫反應；而在DC中的低表達與DC的成熟，抗原遞呈和誘導Th1細胞的極化能力增強有關，這些變化引起機體免疫耐受的破壞，