IL-2和IL-7在調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生和功能中的新作用機(jī)制.pdf

1、第一部分新生小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的“默認(rèn)”產(chǎn)生機(jī)制
　　 目的：CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)能廣譜抑制各種免疫反應(yīng)。但Treg的產(chǎn)生機(jī)制，尤其是在新生小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育時的Treg產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚。本課題擬研究在不同TCR刺激下新生小鼠T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Treg的潛力。
　　 方法：從新生或成年Foxp3/GFP小鼠胸腺或脾臟中分選CD4+Foxp3-T細(xì)胞，予不同的TCR刺激，3天后流式細(xì)胞儀檢測Foxp3/GFP

2、陽性細(xì)胞比例。為鑒定新生小鼠Treg，予CD3/CD28單抗刺激新生小鼠CD4+Foxp3-T細(xì)胞3天后應(yīng)用流式細(xì)胞分選儀分選Foxp3/GFP陽性細(xì)胞(新生小鼠Treg)，并用流式細(xì)胞儀檢測新生小鼠Treg的表型和TCR再刺激時Foxp3表達(dá)的穩(wěn)定性。應(yīng)用3H-胸腺嘧啶攝入法檢測新生小鼠Treg的體外抑制功能。體內(nèi)實驗部分，將CD3單抗腹腔注射入新生或成年小鼠體內(nèi)，或?qū)⑿律虺赡晷∈驝D4+Foxp3-T細(xì)胞過繼輸注入Rag1-/-小

3、鼠體內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測Treg的產(chǎn)生。
　　 結(jié)果：在不同方式的TCR刺激下，在不添加外源性TGF-β和IL-2條件下，高達(dá)70％新生小鼠CD4+Foxp3-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成CD4+Foxp3+Treg，而在相同條件下，成年小鼠Treg轉(zhuǎn)化率低于10％。這些新生小鼠Treg具有抑制功能并相對穩(wěn)定地表達(dá)Foxp3。更重要的是，新生小鼠這種“默認(rèn)”轉(zhuǎn)化成Treg的能力在出生后2周逐漸消失。與體外發(fā)現(xiàn)相符，腹腔注射CD3單抗刺激T細(xì)胞能

4、使新生小鼠Treg增加3倍，而不能顯著增加成年小鼠Treg數(shù)量。將新生或成年小鼠Foxp3-T細(xì)胞過繼輸注入Rag1-/-小鼠，12天后新生小鼠T細(xì)胞的體內(nèi)Treg轉(zhuǎn)化率是成年小鼠的6倍。而令人意外的是，IL-7限制了體外新生小鼠Treg的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：綜上，在TCR刺激時，新生小鼠T細(xì)胞在無外源性IL-2和TGF-β條件下，內(nèi)在地“默認(rèn)”分化成Treg，而IL-7則可能限制了這種“默認(rèn)”產(chǎn)生機(jī)制。
　　 第二部分

5、IL-2信號通路限制獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞前體細(xì)胞的形成但誘導(dǎo)其Foxp3的表達(dá)
　　 目的：胸腺來源的天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTreg)產(chǎn)生的“兩步模型”概念已被接受。本研究將探討外周是否也存在獲得性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iTreg)前體細(xì)胞，以及IL-2在形成這些前體細(xì)胞和誘導(dǎo)其Foxp3表達(dá)的作用。
　　 方法：為確定外周iTreg前體細(xì)胞的存在，分離、提純外周CD4+CD25+Foxp3-細(xì)胞，并予不同的細(xì)胞因子刺激，3天后用流

6、式細(xì)胞儀測定Foxp3表達(dá)。建立“兩步”培養(yǎng)法研究影響iTreg前體細(xì)胞產(chǎn)生的因素。在“兩步”中的“程序化”階段，予不同細(xì)胞因子、中和抗體或通路阻斷劑處理培養(yǎng)細(xì)胞。“程序化”處理3天后，在IL-2刺激下繼續(xù)培養(yǎng)3天(“Foxp3誘導(dǎo)”階段)，流式細(xì)胞儀檢測6天培養(yǎng)細(xì)胞的Foxp3表達(dá)。分選6天培養(yǎng)細(xì)胞中的Foxp3/GFP+細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測該群細(xì)胞的表型和再刺激時Foxp3表達(dá)的穩(wěn)定性，體外和體內(nèi)抑制功能分別通過3H-胸腺嘧啶攝入法

7、和易激性腸炎模型進(jìn)行評估。
　　 結(jié)果：IL-2刺激CD4+CD25+Foxp3-脾臟細(xì)胞能產(chǎn)生超過10％Foxp3+iTreg，而其他γc依賴性細(xì)胞因子沒有類似效果。在CD4+T細(xì)胞接受TCR刺激的“程序化”階段，抑制IL-2-Jak3-Stat5信號通路能產(chǎn)生包含iTreg前體細(xì)胞的CD4+CD25+Foxp3-T細(xì)胞。而在“Foxp3誘導(dǎo)”階段，IL-2是誘導(dǎo)iTreg前體細(xì)胞表達(dá)Foxp3的最強(qiáng)細(xì)胞因子。在6天培養(yǎng)細(xì)胞中

8、，30-40％T細(xì)胞表達(dá)Foxp3，產(chǎn)生iTreg的數(shù)量是初始培養(yǎng)細(xì)胞的5倍以上。盡管在此模型中iTreg的產(chǎn)生不需要加入外源性的TGF-β，阻斷TGF-β信號通路顯著減少iTreg的產(chǎn)生。口兩步模型口產(chǎn)生的iTreg在TCR再刺激時能穩(wěn)定表達(dá)Foxp3，并能在Rag1-/-小鼠中預(yù)防由CD4+CD45RBhighT細(xì)胞介導(dǎo)的易激性腸炎的產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：IL-2-Jak3-Stat5信號通路負(fù)性調(diào)控iTreg前體細(xì)胞的產(chǎn)生，

9、但正性調(diào)控這些前體細(xì)胞表達(dá)Foxp3。
　　 第三部分 IL-2奪獲和TGF-β在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制CD4+CD25-T細(xì)胞活化中的協(xié)同作用
　　 目的：關(guān)于Treg抑制功能機(jī)制目前已有多種觀點，但這些機(jī)制間的相互作用尚未明確。本研究旨在探討其中兩個重要機(jī)制——IL-2奪獲與TGF-β在Treg抑制功能中的相互作用。
　　 方法：在圓底培養(yǎng)板或transwell系統(tǒng)進(jìn)行的體外抑制試驗中，反應(yīng)細(xì)胞(

10、Tconv)接受同基因抗原提呈細(xì)胞(APCs)和可溶性CD3單抗刺激，并與Treg共培養(yǎng)，予IL-2中和抗體、TGF-β或TGF-β中和抗體處理細(xì)胞。3天后用流式細(xì)胞儀檢測Tconv的活化、增殖和存活情況。在某些抑制試驗中，Tconv來自IL-2-/-小鼠或Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠。
　　 結(jié)果：在體外抑制試驗中，組成性表達(dá)Bcl-2的Tconv(體外培養(yǎng)中具有抗凋亡特性)并不能逆轉(zhuǎn)Treg的抑制作用。而通過增加鈣內(nèi)流、強(qiáng)化共刺激信

11、號或加入細(xì)胞因子等方式增強(qiáng)Tconv的活化能逆轉(zhuǎn)Treg的抑制作用。Treg不能抑制已活化的Tconv，而能抑制幼稚性T細(xì)胞活化標(biāo)記性分子的表達(dá)，提示Treg是通過抑制Tconv的早期活化介導(dǎo)其抑制功能的。有趣的是，IL-2奪獲和TGF-β，這兩個Treg抑制機(jī)制，單獨作用并不能有效抑制Tconv的活化和增殖。而兩者聯(lián)合作用能產(chǎn)生類似于Treg的抑制功能。Transwell系統(tǒng)顯示兩者均參與了Treg的抑制功能。
　　 結(jié)論：T

12、reg的兩個抑制機(jī)制—IL-2奪獲和TGF-β聯(lián)合作用可能在有效抑制Tconv早期活化中發(fā)揮協(xié)同作用。
　　 第四部分 IL-7在活化期促進(jìn)記憶性CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生
　　 目的：在T細(xì)胞活化期多個活化(抗原，共刺激分子和細(xì)胞因子)信號均影響后續(xù)記憶性T細(xì)胞(Tm)的產(chǎn)生。而IL-7受體不僅高表達(dá)于Tm，同時也高表達(dá)于幼稚性T細(xì)胞(Tn)，本研究將探討在Tn活化期IL-7刺激能否促進(jìn)其存活并增加Tm的產(chǎn)生。
　　

13、 方法：予負(fù)載OVA323-339抗原肽的抗原提呈細(xì)胞(APCs)刺激OT-Ⅱ轉(zhuǎn)基因CD4+T細(xì)胞。在培養(yǎng)的最初兩天，IL-7或IL-7樣細(xì)胞因子TSLP添加到細(xì)胞培養(yǎng)中。6天后檢測培養(yǎng)細(xì)胞的活化、增殖和存活情況，并通過過繼輸注入B6-SJL小鼠以監(jiān)測Tm的產(chǎn)生。
　　 結(jié)果：在T細(xì)胞活化早期，IL-7或TSLP刺激并不顯著影響6天培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞的活化、增殖和葡萄糖攝入。然而，IL-7能顯著減少凋亡細(xì)胞的比例。過繼輸注6天