體外建立CD4+記憶性T細(xì)胞生成模型和分子機(jī)制的初探.pdf

1、免疫記憶性是機(jī)體對(duì)外界病原體最有效的抵抗機(jī)理，可保證機(jī)體再次遇到同一病原體時(shí)迅速啟動(dòng)免疫防御機(jī)理消滅病原體，也是疫苗作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。免疫記憶系統(tǒng)由體液免疫記憶和細(xì)胞免疫記憶兩部分構(gòu)成，承擔(dān)體液免疫系統(tǒng)記憶功能的為記憶性B細(xì)胞(memory B cells,Bm),承擔(dān)細(xì)胞免疫系統(tǒng)記憶功能的為記憶性T細(xì)胞(memory Tcells,Tm)。人Tm的特征性表面標(biāo)志是CD45RO+，在小鼠體內(nèi)根據(jù)其歸巢部位的不同和表達(dá)趨化因子受體不同，Tm

2、分為效應(yīng)型記憶性T細(xì)胞(CD44+CD62L-CCR7-）和中樞型記憶性T細(xì)胞(CD44+CD62L+CCR7+）。對(duì)于記憶T細(xì)胞來(lái)源存在線性 (或定向)分化和非線性(或不對(duì)稱)分化兩種模式。線性分化模式認(rèn)為：初始T細(xì)胞先分化為能分泌細(xì)胞因子的效應(yīng)細(xì)胞，然后其中很少的一部分轉(zhuǎn)化為記憶細(xì)胞。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為Tm 來(lái)源于一類較遲到達(dá)免疫應(yīng)答晚期階段的前體細(xì)胞。非線性分化模式則認(rèn)為一部分活化的初始T細(xì)胞不經(jīng)過(guò)效應(yīng)T細(xì)胞階段直接分化為記憶細(xì)胞。最

3、近的研究表明，記憶細(xì)胞的來(lái)源更傾向于線性分化模式。體內(nèi)研究證明，與CD8+T細(xì)胞不同，IL-7對(duì)CD4+Tm的形成起了至關(guān)重要的作用。IL-7-/-小鼠和IL-7R表達(dá)突變的小鼠在抗原刺激后不能形成CD4+Tm。在CD4+T細(xì)胞反應(yīng)性增殖的高峰期增強(qiáng)IL-7信號(hào)，可以促進(jìn)TCR 轉(zhuǎn)基因小鼠的效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖以及上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，阻止其在收縮期死亡，從而增加CD4+Tm。在T細(xì)胞收縮期注入IL-2,IL-7 或IL-15 都可以

4、使CD8+T細(xì)胞收縮期減緩。在收縮期體內(nèi)注入IL-2 或IL-15后，主要積聚的是KLRG1hi CD127 lo的短期存活效應(yīng)和記憶細(xì)胞，而注入IL-7 則主要積聚KLRG1lo CD127 hi的長(zhǎng)期存活記憶細(xì)胞。但體內(nèi)研究只能證明細(xì)胞因子對(duì)CD4+Tm分化的影響，并不能了解誘導(dǎo)CD4+Tm分化的分子機(jī)理。因此人們將CD4+Tm分離出來(lái)，研究CD4+Tm 自穩(wěn)性存活和再刺激后增殖的分子機(jī)理。研究的靶細(xì)胞主要有兩類：小鼠自發(fā)分化的記憶

5、表型T細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞。在正常生理?xiàng)l件下，兩類CD4+Tm的自穩(wěn)均需要IL-7和IL-15。記憶表型CD4+Tm的快速增殖還需要MHC-II 類分子，抗原特異性CD4+Tm的快速增殖不需要MHC-II 類分子而主要依賴IL-7。IL-7R 高表達(dá)于靜息T細(xì)胞，當(dāng)T細(xì)胞被激活后，IL-7Ra (CD127)迅速下調(diào)，僅少數(shù)可轉(zhuǎn)化為Tm的效應(yīng)細(xì)胞再次表達(dá)IL-7Ra。在CD8+T細(xì)胞已經(jīng)證明，IL-7Ra的表達(dá)對(duì)檢測(cè)記憶細(xì)胞前體很有作

6、用。鑒于目前對(duì)CD4+Tm分化主要是體內(nèi)研究，尚無(wú)體外模型。為了能深入研究CD4+Tm分化的機(jī)理，我們擬首先以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44和 CD62L表達(dá)作為指標(biāo)，用IL-7 刺激建立體外誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的模型；然后用不同細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合刺激，觀察其誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的能力；再通過(guò)CFSE 標(biāo)記和抗原再刺激驗(yàn)證體外增殖的細(xì)胞確為CD4+Tm；最后以實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blotting等檢測(cè)探討CD4+T

7、m 形成的分子機(jī)制。
　　 第一部分 體外建立CD4+Tm 生成模型
　　 目的：最初考慮用OT-II小鼠CD4+T細(xì)胞來(lái)建立本模型。但由于OT-II小鼠飼養(yǎng)困難，數(shù)量不足，所以擬以FBS作為抗原，用野生型C57BL/6小鼠CD4+T細(xì)胞來(lái)建立本模型，并與OVA 刺激的OT-II小鼠CD4+T細(xì)胞比較，證明本模型的實(shí)用性。用抗原處理的DC和IL-7在體外刺激初始CD4+T細(xì)胞，在不同時(shí)間檢測(cè)T細(xì)胞表達(dá)CD44和CD62L

8、的情況和再次抗原刺激增殖情況，建立體外誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的模型，為探討體外誘導(dǎo)CD 4+Tm 生成的條件打下基礎(chǔ)。
　　 方法：無(wú)菌條件下分別取OT-II和C57BL/6的股骨和脛骨,提取骨髓細(xì)胞在體外分別用FBS 或OVA 刺激，加入IL-4(1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的成熟DC(mature dendritic cell, OVA-DC或FBS-DC)。無(wú)菌條件下分別取OT-II和C57B

9、L/6小鼠脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選CD4+T細(xì)胞；將OVA-DC與OT-II CD4+T細(xì)胞1:10混合，F(xiàn)BS-DC與C57BL/6CD4+T細(xì)胞也以同比例混合，用含IL-7(1ng/ml)的10％FBS 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，96孔板每孔1×105細(xì)胞，每3天半量換液一次，分別在第5天、10天、15天、20天、25天、30天時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面分子CD44,CD62L的表達(dá)情況；同時(shí)在第30天收集細(xì)胞標(biāo)記CFS

10、E后，用OVA-DC 或FBS-D 再刺激，按照 DC：T=1：10的比例將細(xì)胞懸液鋪在96孔板中，72小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)增殖情況；同時(shí)用CFSE 標(biāo)記新鮮分離的OT-II和C57BL/6小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，同樣OVA-DC 或FBS-DC 刺激，48小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)增殖情況作為對(duì)照。
　　 結(jié)果：初始CD4+T細(xì)胞多為CD44 lo CD62L hi，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CD44的表達(dá)逐漸升高，CD62L表達(dá)降低

11、；OVA-DC 刺激OT-II小鼠CD4+T細(xì)胞組高達(dá)80％以上，在FBS-DC 刺激C57BL/6小鼠CD4+T細(xì)胞組最后CD44 hi CD62L lo細(xì)胞比例在70％左右。兩組CD4+Tm表達(dá)CD44和CD62L的模式相似；增殖實(shí)驗(yàn)示培養(yǎng)了30天的抗原特異性細(xì)胞在再次接觸同種抗原時(shí)反應(yīng)快速，細(xì)胞分裂大部分聚集在第三代、四代、五代。提示此種方法誘導(dǎo)生成的細(xì)胞在表型和功能上都具備CD4+Tm的特征。
　　 結(jié)論：在體外，IL-

12、7 可以誘導(dǎo)CD4+Tm 生成。用FBS 刺激誘導(dǎo)C57BL/6小鼠CD4+Tm 生成的狀況與用OVA刺激誘導(dǎo)OT-II小鼠CD4+Tm 生成的狀況相似，說(shuō)明可以用野生型C57BL/6小鼠CD4+T細(xì)胞代替OT-II小鼠CD4+T細(xì)胞進(jìn)行CD4+Tm 生成機(jī)理的研究，所以我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)均用FBS作為抗原研究誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的條件和機(jī)理。
　　 第二部分不同細(xì)胞因子對(duì)體外誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的影響
　　 目的：我們

13、選用細(xì)胞因子IL-2,IL-4,IL-7,IL-15,IFN-γ，F(xiàn)lt-3L,TGF-β在體外誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞，觀察T細(xì)胞表型CD44和CD62L的表達(dá)情況和再次抗原刺激的增殖情況，探討各種相關(guān)細(xì)胞因子分別與CD4+Tm 產(chǎn)生的關(guān)系。
　　 方法：無(wú)菌條件下取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨, 提取骨髓細(xì)胞在體外用FBS 刺激，加入IL-4 (1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的成熟FBS-DC。無(wú)

14、菌條件下取C57BL/6小鼠脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選CD4+T細(xì)胞；將C57BL/6小鼠的BMDC與CD4+T細(xì)胞1:10混合，分別在含IL-2(50U/ml),IL-7(1ng/ml),IL-15(5ng/ml),IL-4 (10ng/ml),IFN-γ (10ng/ml),Flt-3L(5ng/ml),TGF-β(1ng/ml),IL-7+IL-2和IL-7+IL-15 10％FBS1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，96孔板每孔1×105

15、細(xì)胞，每3天半量換液一次，分別在第5天、10天、15天、20天、25天、30天時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞表面分子CD44,CD62L的表達(dá)情況；同時(shí)在第30天時(shí)分別收集存活下來(lái)的細(xì)胞標(biāo)記CFSE后，用FBS-DC 再刺激，按照 DC：T=1：10的比例將細(xì)胞懸液鋪在96孔板中，72小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)增殖情況。
　　 結(jié)果：?jiǎn)为?dú)用細(xì)胞因子IL-4,IL-15,IFN-γ，F(xiàn)lt-3L,TGF-β等培養(yǎng)的體系中，細(xì)胞不到

16、20天全部死亡，而細(xì)胞因子IL-2,IL-7,IL-7+IL-2和IL-7+IL-15 培養(yǎng)體系細(xì)胞存活下來(lái)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CD44的表達(dá)逐漸升高，CD62L表達(dá)降低；另外細(xì)胞因子IL-2和IL-7+IL-2 培養(yǎng)體系組其CD44 hi CD62L lo細(xì)胞的產(chǎn)生時(shí)間在10天左右，而且所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組；增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與其他組相比，IL-2和IL-7+IL-2組的細(xì)胞增殖能力顯著減弱，其相互之間無(wú)明顯差別；IL-7+IL-

17、15組與單獨(dú)IL-7組無(wú)明顯差別。提示IL-2只能有效地活化CD4+T細(xì)胞，其誘導(dǎo)生成與CD4+Tm表型相符的細(xì)胞，但不具備再次免疫應(yīng)答時(shí)快速增殖的性能；同時(shí)在和IL-7 共培養(yǎng)體系中，有抑制IL-7的功能，導(dǎo)致不能有效誘導(dǎo)CD4+Tm 生成。
　　 結(jié)論：IL-4,IL-15,IFN-γ，F(xiàn)lt-3L,TGF-β等細(xì)胞因子單獨(dú)在體外不能誘CD4+Tm的生成，同時(shí)在IL-7+IL-15培養(yǎng)組與單獨(dú)IL-7 培養(yǎng)組無(wú)差別；IL-2

18、不能誘導(dǎo)生成CD4+Tm，并且抑制了IL-7 誘導(dǎo)生成CD4+Tm的功能。查閱文獻(xiàn)，未見(jiàn)關(guān)于IL-2能抑制IL-7 誘導(dǎo)CD4+Tm 生成的報(bào)道。由于IL-15 同樣使用IL-2R和γ c作為受體的一部分，且IL-15 并不抑制IL-7誘導(dǎo)的CD4+Tm 生成，說(shuō)明IL-2的抑制作用可能不是由于通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)γ c，而與其他信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 第三部分 CD4+Tm 體外生成的分子機(jī)制初探
　　 目的：檢測(cè)細(xì)胞因子IL

19、-7在體外誘導(dǎo)生成CD4+Tm細(xì)胞有關(guān)信號(hào)分子和凋亡蛋白的表達(dá)情況，初步探討IL-7 誘導(dǎo)生成CD4+Tm的機(jī)制。
　　 方法：無(wú)菌條件下取C57BL/6小鼠的股骨和脛骨, 提取骨髓細(xì)胞在體外用FBS 刺激，加入IL-4(1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)誘導(dǎo)骨髓來(lái)源的成熟FBS-DC；無(wú)菌條件下取C57BL/6小鼠脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，磁珠分選CD4+T細(xì)胞；將C57BL/6小鼠的BMDC與CD4+T細(xì)胞1:10混

20、合，用分別含IL-7(1ng/ml),IL-2(50U/ml),IL-7+IL-2的10％FBS1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，96孔板每孔1×105細(xì)胞，每3天半量換液一次，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分別在第5d,10d,15d,20d,25d,30d 檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4,IFN-γ，Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平；另外在培養(yǎng)的第30d 用Western-blotting 檢測(cè)STAT5/p-STAT5(Y694),AKT/p-AKT,

21、pro-Caspase-3/ActiveCaspase-3, Bcl-2等分子的蛋白表達(dá)水平；同時(shí)用剛分離出來(lái)的初始CD4+T細(xì)胞做相同的檢測(cè)。
　　 結(jié)果：與初始CD4+T細(xì)胞組相比，IL-7 培養(yǎng)體系的IL-4,IFN-γ，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平都顯著增高，同時(shí)Bcl-2,p-STAT5的蛋白水平增高，Bax，Active Caspase-3的表達(dá)降低。提示IL-7 可能通過(guò)JAK/STAT信號(hào)途徑作用于抗凋亡蛋白Bc