巨噬細胞極化與記憶性T細胞維持中的糖原代謝調(diào)控及作用研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 巨噬細胞向M1型極化中的糖原代謝變化及作用研究
　　目的：本研究發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞中糖原代謝增強，進而解釋在M1型巨噬細胞的極化、功能及存活中糖原代謝的變化。并進一步研究了磷酸戊糖代謝途徑與巨噬細胞向M1型極化的關(guān)系。
　　方法：（1）使用小鼠骨髓來源的巨噬細胞誘導(dǎo)為M1型或M2型并使用電鏡、PAS染色以及糖原檢測試劑盒等檢測胞內(nèi)糖原含量，使用Real-time PCR的方法

2、檢測糖原代謝途徑相關(guān)基因的表達；（2）使用葡萄糖檢測試劑盒檢測M0，M1及M2型巨噬細胞攝取葡萄糖的效率，使用Real-time PCR的方法檢測巨噬細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，己糖激酶基因以及糖異生相關(guān)基因的表達；（3）以siRNA沉默Gys1以及Pygl的表達后，使用Real-time PCR的方法檢測M1型巨噬細胞的表型與功能相關(guān)基因的表達，并使用GPI抑制糖原代謝途徑的流通，使用Real-time PCR，ELISA以及NO檢測試劑盒

3、，檢測M1型表型相關(guān)基因的表達，以及相關(guān)細胞因子的分泌和NO水平；（4）以siRNA沉默Gys1以及Pygl的表達，或以GPI處理巨噬細胞，使用LDH檢測試劑盒檢測對M1型巨噬細胞存活的影響；（5）使用ROS熒光探針檢測GPI處理后M1型巨噬細胞胞內(nèi)ROS水平；（6）使用Real-time PCR，NADPH和GSH檢測試劑盒檢測M0，M1或M2型巨噬細胞磷酸戊糖代謝途徑的水平；（7）以GPI，6AN及OT抑制糖原代謝途徑以及磷酸戊糖代

4、謝途徑后，使用NADPH、GSH及糖原檢測試劑盒檢測巨噬細胞內(nèi)NADPH、GSH及糖原水平，并在GPI，6AN或OT處理細胞的同時加入GSH，使用試劑盒檢測胞外LDH的水平；（8）以6AN或OT抑制磷酸戊糖代謝途徑的流通，檢測M1型巨噬細胞表型與功能相關(guān)基因的表達及分泌促炎細胞因子與NO的能力；（9）以NOX2抑制劑DPI處理巨噬細胞并檢測其胞內(nèi)ROS水平，并探究M1型巨噬細胞分泌促炎細胞因子及NO的能力；（10）GPI處理小鼠后，以L

5、PS建立感染性休克小鼠模型，以conA建立小鼠肝炎模型，檢測其血清中促炎細胞因子水平，以及小鼠生存率或肝臟損傷情況。
　　結(jié)果：（1）與M0型及M2型巨噬細胞相比M1型巨噬細胞糖原含量更高，且糖原代謝途徑增強；（2）M1型巨噬細胞是通過從胞外轉(zhuǎn)運的大量葡萄糖而富集大量的糖原；（3）抑制糖原代謝途徑會抑制M1型巨噬細胞的極化與功能；（4）siRNA或GPI抑制糖原代謝途徑會使M1型巨噬細胞LDH釋放增多；（5）抑制M1型巨噬細胞的糖

6、原代謝途徑會產(chǎn)生更多的ROS；（6）M1型巨噬細胞磷酸戊糖代謝途徑水平增強；（7）外源GSH可以恢復(fù)GPI、6AN或OT對M1型巨噬細胞造成的損傷；（8）抑制磷酸戊糖代謝途徑也會抑制M1型巨噬細胞的極化與功能，并影響巨噬細胞的存活；（9）DPI抑制M1型巨噬細胞ROS的產(chǎn)生，會抑制其極化與功能；（10）在LPS誘導(dǎo)的感染性休克小鼠以及conA誘導(dǎo)的肝炎小鼠模型中，抑制糖原代謝通路的流通，會降低小鼠血清中相關(guān)促炎細胞因子的水平。
　

7、　結(jié)論：巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞時從胞外吸收大量葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，糖原富集且糖原代謝途徑明顯增強，糖原分解產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖可流向磷酸戊糖代謝途徑，磷酸戊糖代謝途徑可以提供大量的NADPH以產(chǎn)生GSH減輕細胞的氧化應(yīng)激，維持細胞ROS在一定水平，可保證M1型巨噬細胞的極化、功能與存活。而過低的ROS也會影響M1型巨噬細胞極化與功能。M1型巨噬細胞極化時的這種代謝方式的轉(zhuǎn)變，可能為治療炎癥提供一種新的方法。
　　第二

8、部分 PCK1介導(dǎo)的糖原代謝調(diào)控CD8+記憶性T細胞形成和維持的研究
　　目的：利用OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠和T細胞過繼模型獲得CD8+記憶性T細胞(CD8+Tm)，通過研究CD8+Tm形成過程中糖異生代謝途徑的改變，探索糖異生途徑關(guān)鍵酶PCK的表達對CD8+Tm形成的影響，并研究糖原代謝途徑對其形成及維持的影響，為尋找調(diào)節(jié)CD8+Tm形成的關(guān)鍵代謝靶點提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：（1）從過繼了OT-I CD8+T細胞的小鼠體內(nèi)流式

9、分選得CD8+Tm，或體外用IL-15誘導(dǎo)獲得記憶性T細胞，所得細胞使用Real-time PCR及Western blot的方法檢測細胞內(nèi)糖異生三個關(guān)鍵酶PCK1、FBP1和G6Pase的基因及蛋白水平表達；（2）用電鏡及糖原檢測試劑盒等檢測體內(nèi)外所得CD8+Tm內(nèi)糖原含量，并用Real-time PCR的方法檢測糖原代謝途徑相關(guān)基因的表達；（3）以3-MPA抑制T細胞中PCK1酶活性，并利用PCK1敲除小鼠（PCK1+/-）體系，使

10、用糖原檢測試劑盒檢測CD8+Tm中糖原的含量；（4）用OVA257-264再激活Lm-OVA誘導(dǎo)的Tm，同時以GPI處理，流式檢測效應(yīng)性相關(guān)標(biāo)記；（5）將CD45.1OT-I CD8+T細胞過繼至WT小鼠并感染Lm-OVA，并腹腔注射GPI處理小鼠，在第6天或第30天時流式檢測小鼠體內(nèi)CD8+效應(yīng)性T細胞(CD8+Teff)或CD8+Tm的數(shù)目；（6）并利用PCK1+/-小鼠體系，流式檢測體內(nèi)CD8+Tm的數(shù)目,研究抑制PCK1是否影響

11、記憶性T細胞形成；（7）以GPI、6AN或3-MPA處理IL-15Tm后，使用NADPH及糖原檢測試劑盒檢測胞內(nèi)NADPH及糖原水平；（8）以6AN、GPI、BSO或DNCB處理IL-15Tm后，使用GSH檢測試劑盒檢測GSH/GSSH水平，使用ROS熒光探針檢測ROS水平并使用流式計數(shù)；（9）將WT小鼠過繼CD45.1OT-I CD8+T細胞并感染Lm-OVA，30天后以3-MPA、GPI或6AN在有或無GSH時處理小鼠，流式檢測體內(nèi)

12、Tm數(shù)目；（10）將WT小鼠過繼CD45.1OT-I CD8+T細胞并感染Lm-OVA，同時3-MPA、GPI或生理鹽水作為對照處理小鼠，30天時，皮下接種B16-OVA，觀察小鼠皮下瘤生長大小及生存期，并利用PCK1+/-小鼠體系及過表達PCK1的CD8+Tm，檢測與對照相比小鼠皮下瘤生長的大小。
　　結(jié)果：（1）Tm與Tn及Teff相比，PCK1及FBP1的基因及蛋白水平顯著上調(diào)表達，卻不表達G6pase；（2）在CD8+Tm

13、中糖原含量及糖原代謝相關(guān)基因表達均上調(diào)；（3）3-MPA抑制Tm中PCK1的酶活性使其胞內(nèi)糖原含量下調(diào)，并且與野生型小鼠相比PCK1+/-小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的Tm糖原含量與下調(diào)；（4）GPI處理對Tm的再次激活程度并沒有差異；（5）GPI抑制糖原代謝途徑后對CD8+Teff的數(shù)目并沒有影響，而CD8+Tm的數(shù)目下降；（6）PCK1+/-小鼠Tm的形成數(shù)目與WT小鼠相比減少；（7）6AN、GPI以及3-MPA作用下的作用下，CD8+Tm胞內(nèi)的總

14、ROS水平顯著上調(diào)，CD8+Tm形成的數(shù)目則大大減少；（8）抑制了GSH系統(tǒng)后CD8+TmROS水平上調(diào)，CD8+Tm形成的數(shù)目也減少，而抑制了巰氧還蛋白系統(tǒng)后對胞內(nèi)總ROS水平以及CD8+Tm形成的數(shù)目影響相對較少。（9）GSH處理后，小鼠體內(nèi)Tm數(shù)目都比僅用抑制劑處理增多；（10）3-MPA和GPI處理組小鼠黑色素瘤的生長與對照組相比增大，小鼠的生存率下降，PCK1+/-小鼠組的小鼠皮下黑色素瘤生長與對照相比增大，而PCK高表達組的