2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分細菌脂多糖誘導(dǎo)的小鼠全身系統(tǒng)性炎癥對骨再生的影響
  目的:骨折修復(fù)有賴于骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的密切配合。在諸如某些病理情況如多發(fā)性創(chuàng)傷,糖尿病,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,肥胖,衰老等某些基礎(chǔ)炎癥水平高于正常的情況均能導(dǎo)致骨再生的速度和質(zhì)量下降。本實驗的目的在于應(yīng)用細菌脂多糖構(gòu)建一種高基礎(chǔ)炎癥狀態(tài)模型,以探討單純炎癥狀態(tài)下骨折愈合的細胞生物學(xué)機制。
  方法:對10周大C57BL/6老鼠用三點加壓模型造成非穩(wěn)定性骨折后,連續(xù)7天經(jīng)

2、腹腔注射LPS(3μg/天/老鼠),對照組老鼠注射同等劑量的LPS。分別在骨折的第1天,第3天,第7天,第10天,第14天,第21天心臟采血法收集血漿,并收集骨折側(cè)肢體。用雙抗體夾心ELISA方法檢測血漿中IL-6水平。骨折側(cè)肢體經(jīng)過固定,脫鈣,透明,石蠟包埋后進行石蠟切片。間隔10張切片分別行HallBryant染色。顯微鏡計算每張切片上骨痂大小及成分。選取Cab2T3和ADTC5兩種細胞系分別在不同濃度LPS存在下進行成骨化和成軟骨

3、化誘導(dǎo),應(yīng)用茜素紅和阿爾新藍染色判斷成骨化和成軟骨化程度。
  結(jié)果:LPS連續(xù)7天注射后,LPS組老鼠未出現(xiàn)明顯發(fā)熱,體重降低,活動減少等癥狀。血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),在骨折后24小時LPS與PBS對照組血漿內(nèi)IL-6水平達到峰值,但是LPS組IL-6峰值水平遠高于PBS對照組。骨折后3天,對照組血漿中炎性因子即恢復(fù)至基礎(chǔ)水平,但是LPS組在7天時才緩慢恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,在骨折后第7天,第10天和第14天,LPS組骨痂大

4、小較對照比明顯減小。新生軟骨和新生骨體積LPS組也顯著小于對照組,但軟骨減少更為明顯。細胞實驗結(jié)果提示,LPS能明顯抑制成骨作用和成軟骨化作用。
  結(jié)論:通過腹腔注射LPS可以系統(tǒng)性基礎(chǔ)炎癥水平增高,系統(tǒng)性炎癥水平升高能導(dǎo)致局部骨再生減緩,同時影響骨再生質(zhì)量。
  第二部分骨折修復(fù)過程中巨噬細胞的作用及其表型演變
  目的:骨折發(fā)生后,正常機體能有效募集各種炎性細胞對組織損傷相關(guān)刺激進行應(yīng)答,清除炎癥并啟動組織修復(fù)程

5、序。巨噬細胞作為先天性免疫系統(tǒng)的重要的效應(yīng)細胞,能發(fā)揮清除壞死組織,吞噬細胞碎片,提呈抗原等作用。此外,巨噬細胞能根據(jù)細胞外微環(huán)境尤其是周圍組織炎癥水平呈現(xiàn)不同的極化狀態(tài),表現(xiàn)不同的生物學(xué)功能。在上皮組織傷口愈合中,巨噬細胞的極化和功能變化已經(jīng)大量見諸報道,本研究旨在應(yīng)用Ccr2-/-基因缺陷型老鼠研究巨噬細胞在骨折愈合過程中的作用以及在骨折過程中的表型的動態(tài)改變。
  方法:實驗采用10周大小的Ccr2-/-老鼠作為干預(yù)組,年齡

6、與性別相匹配的正常C57BL/6老鼠作為對照組,判斷Ccr2基因在骨折愈合過程中的作用。運用Yet40和Yarg兩種YFP熒光標(biāo)記老鼠來判斷骨折愈合不同階段M1和M2的數(shù)量。三點加壓法制造非穩(wěn)定性骨折后,不同時間點收集骨折側(cè)肢體,經(jīng)過固定,脫鈣,透明,石蠟包埋后進行石蠟切片,間隔10張切片分別行HallBryant染色,顯微鏡下計算每張切片上骨痂大小及成分。另選取每10張組織切片行免疫組織化學(xué)染色,計數(shù)巨噬細胞和中性粒細胞。骨折后分別于

7、第1,3,5,7,10,14天在顯微鏡下分離骨痂,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后用qPCR方法檢測M1和M2相關(guān)基因。在骨折愈合的第1天和第7天,選取Yet40和Yarg熒光標(biāo)記鼠組織切片做抗YFP染色探討骨折修復(fù)過程中巨噬細胞的表型轉(zhuǎn)化。
  結(jié)果:骨折后第3天,與正常組相比,Ccr2-/-老鼠骨折局部巨噬細胞明顯減少,但是中性粒細胞數(shù)量并未出現(xiàn)顯著下降。骨折第7天,Ccr2-/-基因缺陷鼠較野生型老鼠相比,骨折后骨痂大小顯著性減小(P

8、=0.27),新生骨痂中骨含量和軟骨含量兩組之間并無明顯差異。骨折第14天,骨痂大小無明顯差異,對照組新生骨含量明顯多于Ccr2-/-缺陷組。骨折后第21天,Ccr2-/-組骨痂中新生骨體積和軟骨體積均高于對照組。Yet40和Yarg組實驗組提示,骨折后第1天,M1數(shù)量明顯高于M2,至骨折第7天,結(jié)果顯示M1巨噬細胞數(shù)量減少而M2數(shù)量增多。
  結(jié)論:Ccr2基因缺陷老鼠能阻止巨噬細胞向機體損傷部位募集從而導(dǎo)致骨折愈合延緩,新生骨

9、數(shù)量和質(zhì)量明顯降低,進一步說明巨噬細胞在骨修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。骨折愈合過程中,巨噬細胞表型由M1逐漸向M2表型轉(zhuǎn)變,從促炎癥表型向抗炎癥表型轉(zhuǎn)變,這一轉(zhuǎn)變對清除創(chuàng)傷后局部炎癥,促進組織修復(fù)發(fā)揮積極作用。
  第三部分年齡相關(guān)性巨噬細胞極化對成骨細胞成骨化作用的影響
  目的:巨噬細胞作為一種主要的先天性免疫應(yīng)答細胞和抗原提呈細胞在骨折愈合中發(fā)揮重要作用,年齡能影響巨噬細胞的表型和功能,同時巨噬細胞也能根據(jù)細胞外微環(huán)境的改

10、變而呈現(xiàn)不同的細胞表型。在組織損傷發(fā)生后,一般認(rèn)為巨噬細胞首先呈現(xiàn)促炎表型M1,引發(fā)炎癥和機體免疫應(yīng)答,隨著炎癥的消退,巨噬細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N抗炎表型M2,分泌細胞外基質(zhì)合成膠原等促進組織修復(fù)。本部分研究旨在探討年齡對巨噬細胞極化狀態(tài)的影響,以及在這種年齡相關(guān)的極化狀態(tài)下,巨噬細胞與成骨細胞的相互作用。
  方法:不同年齡組老鼠處死后,收集骨髓中單核細胞。用含有5%CMG12-14細胞系上清液的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細胞誘導(dǎo)生成

11、小鼠巨噬細胞。10ng/mlIFN-γ與10ng/mlLPS加入培養(yǎng)基過夜,誘導(dǎo)生成M1型巨噬細胞,1ng/mlIL-4培養(yǎng)12小時誘導(dǎo)生成M2型巨噬細胞。用ELISA方法分別測量細胞培養(yǎng)上清液中有關(guān)抗炎因子和促炎因子的濃度。用Giess試劑盒測量M1巨噬細胞上清中的NO含量,用Q-PCR方法檢測M2巨噬細胞中的YM1和FIZZ1基因的含量,證實巨噬細胞已活化為目的表型。分別用三種共培養(yǎng)的方式培養(yǎng)巨噬細胞和成骨前體細胞1)標(biāo)準(zhǔn)法混合培養(yǎng)

12、2)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3)Trans-well小室培養(yǎng)。用Q-PCR的方法分別在誘導(dǎo)分化的第3天,第7天,第10天,第14天分別檢查成骨分化的相關(guān)基因ALP,Col1a和Osterix表達情況。在共培養(yǎng)14天后用茜素紅染色和堿性磷酸酶活性檢測的方法來判斷成骨化作用。
  結(jié)果:18月組小鼠巨噬細胞IL-6水平較10周組明顯升高。M1標(biāo)志物NO和M2標(biāo)志物YM1和FIZZ1,18月組均高于10周組。Q-PCR結(jié)果顯示,10周和18周未活

13、化骨髓巨噬細胞對成骨細胞成骨化并未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異性。對于M1巨噬細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下分化的成骨細胞,早期時間點成骨化相關(guān)基因表達水平高于對照,但是晚期時間點表達水平低于同年齡組對照。M2條件培養(yǎng)基下,10周組各個時間點成骨化基因均高于正常,而18周M2組與同年齡組對照并無統(tǒng)計學(xué)差異。標(biāo)準(zhǔn)法混合培養(yǎng)體系下,各年齡組茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)并無顯著差異。在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)和Transwell培養(yǎng)體系下,10周M2組較同年齡M1組相比顯著促進

14、鈣結(jié)節(jié)生成。18月組M1和M2組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量均低于同一年齡正常對照組。
  結(jié)論:體外實驗證實衰老組巨噬細胞較正常成年組呈現(xiàn)出一種更高的基礎(chǔ)炎性狀態(tài),衰老狀況下巨噬細胞本身仍然具有向M1和M2極化的能力,并分泌M1,M2特異性標(biāo)記物的能力。這一研究同樣也說明在長期的炎癥環(huán)境下,成骨細胞成骨作用受損,同時M2巨噬細胞表型能促進成骨細胞分化及成骨作用。因此,調(diào)控巨噬細胞的極化可能是促進如衰老,肥胖,糖尿病等某些長期慢性炎癥情況下骨折修復(fù)

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