降鈣素基因相關肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨分化和骨吸收功能影響的實驗研究.pdf

1、在臨床上我們發(fā)現中樞神經系統(tǒng)損傷（如截癱或者顱腦損傷）的患者若同時伴有四肢長骨骨折時，常常在骨折區(qū)出現大量骨痂的過度生長，嚴重的甚至出現異位骨化，其骨折愈合的速度也快于不伴中樞神經系統(tǒng)受損的四肢長骨骨折患者；相反的若是骨折患者同時伴有明顯周圍神經損傷時，骨折愈合的過程將出現明顯的延長，延遲愈合甚至是骨不愈合的可能增高。大量文獻表明中樞神經受到損傷后，神經肽類物質在外周血液中的濃度升高，這可能是導致骨痂過度生長的重要原因；這些神經肽類物質

2、其中就包括降鈣素基因相關肽(CGRP)和P物質等。降鈣素基因相關肽（CGRP）是一種體內廣泛分布的神經肽，研究發(fā)現其具有促成骨的作用，但是CGRP對骨吸收中破骨前體細胞即骨髓源性巨噬細胞(BMMs)的是否具有調控作用尚不清楚。因此我們課題組設計了相應實驗，來探究CGRP對SD大鼠骨髓源性巨噬細胞（BMMs)破骨分化和骨吸收功能的影響，闡明其影響骨代謝的分子機制，為骨修復和骨重建提供新的思路。
　　實驗一降鈣素基因相關肽對大鼠骨髓源

3、性巨噬細胞破骨分化的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨分化的影響。
　　方法：（1）采用差速貼壁的方法分離出SD大鼠骨髓源性巨噬細胞，原代培養(yǎng)并傳代，而后加入適當濃度的sRANKL和M-CSF，進行大鼠破骨前體細胞的破骨分化誘導。（2）實驗分組：A:空白對照組（不含CGRP）；B：高劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-7mol/L）；C：中劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-8mol/L）

4、；D：低劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-9mol/L）。（3）加入不同濃度CGRP后破骨分化誘導培養(yǎng)7天，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色法（TRAP染色）觀察破骨細胞形態(tài)并對成熟的破骨細胞進行計數分析。(4)加入不同濃度CGRP后破骨分化誘導7天，通過RT-PCR方法檢測破骨分化特異性特基因（RANK、TRAP、NFATc1）mRNA的表達。（5）對加入不同濃度CGRP破骨分化誘導7天后的破骨細胞進行處理，通過Western-blo

5、t檢測破骨特征性TRAP和RANK蛋白的表達。
　　結果：（1）TRAP染色顯示，相對于空白對照組不同濃度CGPR處理組的成熟破骨細胞數目顯著減少，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）并且隨CGRP濃度的增高成熟破骨細胞數減少（P<0.05），組間亦有明顯差異（P<0.05）。（2） RT-PCR檢測破骨分化特異性特基因RANK、TRAP、NFATc1 mRNA和Western-blot測破骨特征性TRAP、RANK蛋白的表達，結果提示不

6、同濃度CGRP組均明顯低于空白對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　結論：本實驗通過體外骨髓源性巨噬細胞誘導培養(yǎng)破骨細胞的方法，觀察到CGRP具有抑制破骨前體細胞破骨分化的作用，提示CGRP在骨修復及骨重建中可能發(fā)揮重要的作用。
　　實驗二降鈣素基因相關肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨誘導后骨吸收功能的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨誘導后骨吸收功能的影響。
　　方法：（1）采用

7、差速貼壁的方法分離出SD大鼠骨髓源性巨噬細胞，原代培養(yǎng)并傳代，而后加入適當濃度的sRANKL和M-CSF，進行大鼠破骨前體細胞的破骨分化誘導。（2）實驗分組：A:空白對照組（不含CGRP）;B：高劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-7mol/L）；C：中劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-8mol/L）；D：低劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-9mol/L）。（3）用不含CGRP的破骨誘導液培養(yǎng)骨髓源性巨噬細胞7天后，采用

8、抗酒石酸酸性磷酸酶染色法（TRAP染色）觀察破骨細胞形態(tài)，并對破骨細胞進行鑒別。（4）在不同時間點，通過WST-1法檢測不同濃度CGRP對大鼠破骨前體細胞BMMs增殖率的影響。（5）加入不同濃度CGRP后將破骨前體細胞BMMs破骨分化誘導7天，通過RT-PCR檢測破骨細胞骨吸收功能性基因MMP-9、Cathepsin K mRNA的表達。（6）將BMMs接種于骨磨片上，用含有不同濃度CGRP的破骨誘導液誘導7天后，對骨磨片行甲苯胺藍染色

9、檢測CGRP對破骨細胞的骨吸收功能的影響。
　　結果：（1）與空白對照組相比，各CGRP處理組對破骨前體細胞BMMs的增殖具有抑制作用，且隨著CGRP濃度的升高，抑制作用更加明顯。（2）RT-PCR結果顯示，與空白對照組相比，CGRP處理組明顯抑制破骨相關酶MMP-9和Cathepsin K mRNA的表達。（3）甲苯胺藍骨磨片染色顯示，與空白對照組相比，CGRP處理組的骨陷窩數目明顯減少，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且CGR