降鈣素對大鼠膝OA模型軟骨退變和軟骨下骨破骨吸收的影響.pdf

1、目的：
　　 改良Hulth法制作大鼠膝骨關節(jié)炎模型，評價造模的有效性；在有效的模型中，分析關節(jié)軟骨和滑膜基質金屬蛋白酶的變化特點；研究降鈣素(Calcitonin，CT)對膝關節(jié)軟骨、滑膜及軟骨下骨改變的影響，探討CT對關節(jié)軟骨的保護作用，以及對軟骨下骨骨吸收的抑制作用。
　　 方法：
　　 105只SD大鼠隨機分為對照組(ACLT+MMx)、降鈣素(CT)干預組和假手術組(Sham)，每組各35只。
　

2、　 (1)改良Hulth法行骨關節(jié)炎(OA)造模，對照組(ACLT+MMx)：前交叉韌帶橫斷和內側半月板切除；Sham組：打開關節(jié)腔，不切斷交叉韌帶和切除半月板；CT組：造模術后第二天始行降鈣素15IU/kg隔日皮下注射，對照組和sham組注射等量的生理鹽水。在造模1w、2w、4w、6w、8w、12w處死大鼠。膝關節(jié)標本肉眼大體觀察，取股骨內側髁軟骨，脛骨內側平臺軟骨下骨及關節(jié)內滑膜作為組織標本，HE染色、甲苯胺藍染色、Masson染

3、色。以Mankin評分為標準，增加Masson染色的結果評分，對OA的病程進行分期。
　　 (2)取軟骨和滑膜標本，軟骨標本來自股骨內側髁。各個時間點的標本經處理后，液氮保存，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測Sox9、Ⅱ型膠原、MMP-1、-3、-13的蛋白含量，實時熒光定量PCR(RealtimePCR)檢測Sox9、Ⅱ型膠原、MMP-1、-3、-13基因表達的變化，分析OA基質金屬蛋白酶的變化特點及降鈣素干預對骨關節(jié)炎軟骨的

4、保護作用。
　　 (3)取各期脛骨內側平臺標本，研磨后提取RNA，實時熒光定量PCR(RealtimePCR)檢測RANK和組織蛋白酶K(CK)表達量的變化，分析降鈣素對OA早期軟骨下骨骨吸收的影響。同時通過HE染色切片計數(shù)軟骨下骨骨小梁的體積、數(shù)目、分離度，比較OA造模后2w和12w時骨小梁的差異。
　　 結果：
　　 (1)大體及組織觀察
　　 對照組：造模2w關節(jié)軟骨失去光澤，色暗，HE染色軟骨細胞

5、數(shù)量輕度增生；4w見軟骨破壞，細胞數(shù)量增多，Masson染色紅染，少許藍色出現(xiàn)；6w軟骨潰瘍破壞明顯，骨贅增生，細胞排列紊亂，Masson染色紅藍相間；8w軟骨缺損，骨贅增生明顯，有軟骨細胞壞死；12w可見軟骨下骨外露，細胞數(shù)量明顯減少。CT組：病理改變時期延后2w。Sham組大體和組織切片接近正常。
　　 (2)ELISA測定和RealtimePCR
　　 對照組和sham組比較：軟骨MMP-1：顯著上調(P＜0．Ol

6、)，組內變化呈下調趨勢(P＜0.01);MMP-3：顯著上調(P＜0.01)，組內變化呈上調趨勢(P＜0.05);MMP-13:顯著上調(P＜0.01)，病程進展呈上調趨勢(P＜0.01)?；ぶ蠱MP-1、-3、-13表達高于sham組，呈上升趨勢(P＜0.01)。
　　 CT組與對照組比較：Sox9的表達上調，變化有差異(P＜0.05)；Ⅱ型膠原在OA造模前4w，表達下調，6w起上調表達，變化有顯著差異(P＜0.01);MM

7、P-1、-13的表達顯著下調(P＜0.01);MMP-3在OA早期(2w)是上調表現(xiàn)(P＜0.01),中晚期是下調(P＜0.01)；CK的表達下調(P＜0.01);RANK的表達在OA早期是下調(P＜0.01)。
　　 (3)骨組織計量學參數(shù)變化
　　 對照組和sham組比較：2w時，骨小梁的體積和骨小梁數(shù)目顯著小于sham組，骨小梁分離度大于sham組(P＜0.01)，軟骨下骨體積和數(shù)目減少，間距增加。12w時骨小梁體

8、積、骨小梁數(shù)目均高于sham組，骨小梁分離度小于sham組(P＜0.01)。
　　 CT組與對照組比較：2w時，骨小梁的體積和骨小梁數(shù)目均高于對照組，骨小梁分離度小于對照組(P＜O.01);12w時沒有顯著差異(P＞0.05)。Sham和Sham+CT組沒有差異(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1．改良Hulth法制作大鼠OA模型，即橫斷前交叉韌帶及內側半月板，是一種較為實用有效的膝關節(jié)OA模型制作方法。M

9、ankin評分能基本反映OA的早、中、晚分期，Masson染色可以作為Mankin評分的補充。
　　 2．引發(fā)軟骨細胞外基質降解的MMPs分泌有時相性。軟骨細胞MMP-1、-13在OA早期是高表達，而MMP-3的表達則是早期低表達，中晚期高表達。
　　 3．滑膜在OA的發(fā)生過程中扮演重要的角色。早期即有降解軟骨的作用，而不僅僅是繼發(fā)的滑膜炎。
　　 4.CT促進關節(jié)軟骨形成和抑制軟骨基質的降解。
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