體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體修復(fù)骨軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見(jiàn)疾病。人口老齡化引起的關(guān)節(jié)軟骨磨損、退行性變和各種創(chuàng)傷、運(yùn)動(dòng)損傷造成的軟骨損傷逐日增多，已經(jīng)成為導(dǎo)致殘廢、影響生活質(zhì)量的重要原因。20世紀(jì)80年代以來(lái)，組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機(jī)遇。人們利用軟骨組織工程技術(shù)，將細(xì)胞和支架材料復(fù)合培養(yǎng)，修復(fù)軟骨缺損已經(jīng)取得了初步成效。本課題研究的目的是采用軟骨組織工程技術(shù)，體外分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為種子細(xì)胞，經(jīng)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)生長(zhǎng)因

2、子的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，與聚羥基乙酸(poly glycolic acid; PLA)一聚乳酸(poly 1actic acid; PGA)共聚物(PLGA)支架材料復(fù)合培養(yǎng)，觀察MSCs在PLGA支架材料上黏附、伸展和增殖情況，并模仿馬賽克骨軟骨移植術(shù)在關(guān)節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC一支架復(fù)合體，淺層置入誘導(dǎo)培養(yǎng)后的MSC一支架復(fù)合體，緊密壓配，體內(nèi)構(gòu)建骨軟骨復(fù)合體，觀察其修復(fù)的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞和支架材料。材料和方法

3、 1.取10-12月齡健康比格犬3只，無(wú)菌穿刺抽取髂骨骨髓7-8ml，Percoll分離 法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。取第3代的MSCs，根據(jù)是否加入TGFβ<,1>，分為二組：A組，加入TGFβ<,1>10ng/ml；B組，對(duì)照組。二組中常規(guī)加入含10％胎牛血清的DMEM液。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，誘導(dǎo)培養(yǎng)15天后，MTT法觀察細(xì)胞增殖狀況：細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)糖胺聚糖的含量；免疫組化檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞Ⅱ

4、型膠原的分泌。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的情況。 2取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)7天的MSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為5x10<'6>/ml，與PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)7天，進(jìn)行復(fù)合組織的病理形態(tài)學(xué)觀察；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)備用。PLGA支架及MSCs-PLGA支架復(fù)合體進(jìn)行掃描電鏡觀察。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在PLGA支架內(nèi)生長(zhǎng)增殖情況。掃描電鏡觀察PLGA支架材料的結(jié)構(gòu)、孔隙率和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架內(nèi)的黏附和生長(zhǎng)情況。 3取10-12月齡健康比

5、格犬10只，在實(shí)驗(yàn)犬的雙側(cè)股骨滑車處鉆直徑5mm，深度5mm的骨軟骨缺損，深達(dá)軟骨下區(qū)。隨機(jī)分為3組：A組，作為實(shí)驗(yàn)組，10只，左膝軟骨缺損處深層植入MSCs復(fù)合PLGA支架材料，淺層植入經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs復(fù)合PLGA支架材料，緊密壓配；B組，作為陰性對(duì)照組，10只，陰性對(duì)照組，左膝軟骨缺損處植入MSCs復(fù)合PLGA支架材料；C組，空白對(duì)照組，10只，為上述兩組的右膝軟骨缺損處，不植入任何材料。分別于術(shù)后12、16周處死取材，進(jìn)行大

6、體和組織學(xué)觀察。 結(jié)果 1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞接種后1-3日可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，呈短梭形。3日后出現(xiàn)細(xì)胞集落，7-8日廣泛集落形成。12-14同細(xì)胞形成單層。傳代細(xì)胞貼壁快，7-8日形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆 粒多。力入細(xì)胞因子后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，呈漩渦狀生長(zhǎng)。 2 加入細(xì)胞因子TGFβ<,1>(A組)的MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖(GAG)含量和II型膠原分泌均明顯

7、高于對(duì)照組(B組)。II型膠原免疫組化陽(yáng)性的MSCs胞漿染色為黃色或棕黃色。 3 電鏡觀察：掃描電鏡顯示PLGA支架呈不規(guī)則多孔狀，孔徑控制在200-300μm，孔徑率85％，孔壁厚度較均勻，為20-40μm。復(fù)合材料顯示MSCs細(xì)胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見(jiàn)到細(xì)胞分泌的基質(zhì)和細(xì)胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細(xì)胞親和性。 4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 大體觀察：術(shù)后16周，實(shí)驗(yàn)組缺損修復(fù)區(qū)組

8、織與周圍關(guān)節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無(wú)差異；陰性對(duì)照組缺損區(qū)修復(fù)組織與周圍軟骨部分整合在一起，光澤較差；空白對(duì)照組缺損處修復(fù)組織低凹，新生組織軟，無(wú)光澤，與周圍軟骨組織區(qū)別明顯。 組織學(xué)觀察：術(shù)后16周，實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細(xì)胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律，表面層的軟骨細(xì)胞平行關(guān)節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復(fù)，與周圍正常軟骨連接較好。陰性

9、對(duì)照組軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，中央修復(fù)區(qū)大部分為纖維組織修復(fù)。空白對(duì)照組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織。 結(jié)論 1 MSCs適合成為軟骨組織工程的種子細(xì)胞。取材方便，Percoll分離法分離可 以獲取大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴(kuò)增，在一定 誘導(dǎo)條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細(xì)胞。 2 TGF-β 1在促進(jìn)MSCs細(xì)胞增殖和向軟骨細(xì)胞定向分化方面有顯著的作用，均明顯高于對(duì)照組。 3 PLGA