模塊法構(gòu)建多級(jí)骨組織和新型水凝膠修復(fù)軟骨缺損的研究.pdf

1、本研究主要圍繞骨，軟骨的組織工程修復(fù)來開展，針對(duì)骨，軟骨領(lǐng)域中不同的問題采用了不同的解決策略。
　　研究內(nèi)容：
　　一、成骨模塊
　　目的:利用復(fù)合納米羥基磷灰石的PCL/gelatin納米纖維，模擬骨骼中的礦化膠原纖維，制備成骨性模塊。
　　材料與方法:靜電紡絲法制備nHA/PCL/gelatin納米纖維:
　　稱取PCL和明膠各1g分別加至10ml三氟乙醇中進(jìn)行磁力攪拌4h，取PCL和明膠溶液各5ml混

2、合后繼續(xù)攪拌2h。將500mg nHA混合入1ml2％ F-127溶液中超聲促分散，再按比例將納米羥基磷灰石加入到聚合物溶液中，得到nHA占聚合物的比例為10wt％，20wt％，40wt％，得到三種混合液。將混合液加至注射器中，安裝至推注器上，調(diào)整速度為1ml/h，電壓為15kv，采用不銹鋼框接收，接收距離為15cm。接收時(shí)間為1h。
　　nHA/PCL/gelatin納米纖維的物理表征
　　利用SEM，TEM，XRD，TG

3、A對(duì)nHA/PCL/gelatin納米纖維進(jìn)行有關(guān)物理性能表征。
　　nHA/PCL/gelatin納米纖維的生物相容性檢測和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)檢測
　　取SD大鼠原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增至第三代應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。按5×103/cm2把ADSCs種植到纖維膜上，在24h后和第3天后進(jìn)行l(wèi)ive/dead染色，分析細(xì)胞存活情況。取24h后和第3天樣品，2.5％戊二醛固定，制備電鏡觀察樣品，SEM分析細(xì)胞在纖維膜表面生長形態(tài)。加入成骨

4、誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)14天后，進(jìn)行茜素紅染色;OCN和RUNX2免疫熒光檢測，分析陽性細(xì)胞率，以單純培養(yǎng)第3天樣品為對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:nHA/PCL/gelatin納米纖維物理特性
　　根據(jù)SEM分析，在加入nHA后，隨著濃度的升高，對(duì)納米纖維膜表面有一定程度的影響。在10wt％，20wt％的比例時(shí)候，膜表面平整，纖維隨機(jī)分布，孔隙均勻，適合作為支架材料，在加入到40％后，纖維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不規(guī)則球狀，纖維分布不均勻。TEM

5、觀察，10wt％，20wt％的nHA均包含在纖維內(nèi)部，散在分布，40wt％時(shí);出現(xiàn)聚集，對(duì)纖維形態(tài)產(chǎn)生影響。分析XRD，在復(fù)合納米纖維中檢測出nHA的晶體結(jié)構(gòu)峰值，且晶體結(jié)構(gòu)完整，靜電紡絲過程對(duì)納米羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)影響不大。熱重分析各個(gè)比例復(fù)合納米纖維發(fā)現(xiàn)，紡絲中nHA含量與設(shè)計(jì)基本一致。綜合物理表征，我們選擇20wt％的nHA/PCL/gelatin納米纖維進(jìn)行下一步研究。
　　nHA/PCL/gelatin納米纖維的生物學(xué)特性

6、
　　本研究采用大鼠脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，在種植后24h，第3天后live/dead染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在膜上存活狀態(tài)良好，染成紅色的死細(xì)胞比例低于5％，第三天細(xì)胞數(shù)量較第一天明顯增多，說明細(xì)胞增殖狀況良好。電鏡掃描分析，在種植后的24h，和第3天發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與納米纖維粘附緊密，細(xì)胞逐漸從梭形鋪展開來，在誘導(dǎo)14天后可成片的細(xì)胞，并觀察到大量鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)。茜素紅染色在對(duì)比種植第3天和誘導(dǎo)第14天發(fā)現(xiàn)，脂肪干細(xì)胞細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞效果明顯，結(jié)

7、合OCN和RUNX2的免疫熒光，誘導(dǎo)第14天的陽性細(xì)胞率顯著高于種植第3天的陽性細(xì)胞率(p＜0.05)。
　　結(jié)論:本研究通過物理性能表征和生物學(xué)檢測，證明含20wt％的nHA的復(fù)合納米纖維可做為成骨誘導(dǎo)的支架材料，結(jié)合納米纖維的微納米結(jié)構(gòu)，是作為bottom-up組織工程的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建多級(jí)骨組織的理想材料。
　　二、血管模塊
　　目的:制備血管模塊，利用材料的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，聚多巴胺和血小板共同誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為內(nèi)皮

8、細(xì)胞。
　　材料與方法:稱取PCL和明膠各1g加至10ml三氟乙醇溶液中進(jìn)行磁力攪拌4h，取PCL和明膠溶液各5ml混合后繼續(xù)攪拌2h。將混合液加至注射器中，安裝至推注器上，調(diào)整推注速度為lml/h，電壓為15kv，采用高速取向器接收，接收距離為15cm。接收時(shí)間為30min。將接受的靜電紡絲，置于戊二醛蒸汽下交聯(lián)1h。配制2mg/ml多巴胺溶液:稱取200mg多巴胺，溶于100ml pH=8.5的50mMTris-HCL緩沖液中

9、。將制備的納米纖維膜浸入至多巴胺溶液中，過夜，取出纖維膜采用超純水清洗表面多次，氮?dú)飧稍飩溆谩ＨD大鼠全血，兩次離心法制備血小板，用DMEM稀釋后，將膜浸入到含血小板的DMEM中，37℃2h后，取出樣品采用DMEM洗三次，去掉未粘附的血小板。
　　準(zhǔn)備第三代大鼠脂肪干細(xì)胞，以5×103/cm2種植到纖維膜上，共分4組膜來種植細(xì)胞分別為1）PCL/gelatin納米纖維膜，2）PCL/gelatin納米纖維膜+血小板，3）PCL/

10、gelatin納米纖維膜+多巴胺+血小板，4）PCL/gelatin納米纖維膜（加EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基），前三組加入普通培養(yǎng)基，第四組為陽性對(duì)照加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
　　納米纖維膜的物理表征
　　對(duì)纖維膜的表面形貌，纖維的走向，多巴胺的粘附，血小板的粘附進(jìn)行SEM表征。對(duì)纖維膜多巴胺修飾前后的親水性采用靜態(tài)接觸角進(jìn)行表征。
　　生物相容性和內(nèi)皮分化鑒定
　　采用live/dead染色分析細(xì)胞的存活情況，采用免

11、疫熒光染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31和vWF的表達(dá)。
　　結(jié)果:根據(jù)SEM結(jié)果分析，靜電紡絲采用高速取向器可得到平行排列的納米纖維，纖維結(jié)構(gòu)均勻，間隙勻稱。進(jìn)行多巴胺修飾后高倍掃描可見纖維表面粘附有聚多巴胺納米膜。掃描電鏡觀察多巴胺修飾前后的纖維膜粘附血小板的情況發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)修飾的血小板粘附數(shù)量少，大部分處于激活狀態(tài)，經(jīng)過多巴胺修飾后血小板粘附數(shù)量與未經(jīng)修飾組比較明顯增多(p＜0.05)，大量血小板仍保持未激活狀態(tài)。Live/

12、dead染色分析，血小板促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖，與其他組別對(duì)比培養(yǎng)3天后細(xì)胞數(shù)目較多，大量細(xì)胞沿納米纖維走向排列，呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。免疫熒光鑒定發(fā)現(xiàn)PCL/gelatin納米纖維膜+多巴胺+血小板組的細(xì)胞陽性率顯著高于前兩個(gè)對(duì)照組(p＜0.05)，與加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基的陽性對(duì)照組無差別（p＞0.05）。
　　結(jié)論:本研究采用納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，聚多巴胺和血小板聯(lián)合作用于脂肪干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化。綜合物理表征和內(nèi)皮細(xì)胞表征物鑒

13、定，PCL/gelatin納米纖維膜+多巴胺+血小板可作為內(nèi)皮化結(jié)構(gòu)單元參與骨多級(jí)組裝，構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)。
　　三、磁性模塊
　　目的:制備磁性納米纖維膜結(jié)構(gòu)單元充分實(shí)現(xiàn)無接觸，無創(chuàng)的磁場操控。
　　材料與方法:首先采用化學(xué)共沉淀法制備超順磁性納米顆粒SPIONs。分別稱取PCL和明膠各1g加至10ml三氟乙醇溶液中進(jìn)行磁力攪拌4h，取PCL和明膠溶液各5ml混合后繼續(xù)攪拌2h。先將500mg SPIONs混合1ml2％

14、F-127溶液中超聲促分散，再按比例將SPIONs加入到聚合物溶液中，得到SPIONs占聚合物的比例為2.5wt％，5wt％，10wt％的三種混合液。將混合液加至注射器中，安裝至推注器上，調(diào)整速度為lml/h，電壓為15kv，采用不銹鋼框接收，接收距離為15cm。接收時(shí)間為1h
　　磁性納米顆粒和磁性納米纖維的物理表征
　　對(duì)得到磁性納米顆粒和磁性納米纖維膜進(jìn)行SEM，TEM，F(xiàn)TIR，XRD，磁性分析。
　　磁性組裝

15、測試。
　　結(jié)合層層疊加，將5層磁性納米纖維膜進(jìn)行磁性組裝實(shí)驗(yàn)。
　　磁性納米纖維的生物學(xué)檢測和MRI成像測試
　　利用live/dead染色分析磁性納米纖維膜對(duì)脂肪干細(xì)胞的毒性。利用超順磁性納米粒子在MRI成像技術(shù)上的優(yōu)勢，將磁性膜植入到大鼠腹部皮下，觀察利用磁性膜對(duì)移植體的示蹤和無創(chuàng)檢測效果。
　　結(jié)果:根據(jù)SEM和TEM分析，加入磁性顆粒后，纖維膜結(jié)構(gòu)變得較為致密，孔隙變小，纖維直徑變小。磁性顆粒在纖維中散

16、在分布，沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的聚集情況。磁性分析發(fā)現(xiàn)，單純的磁性納米顆粒的磁飽和度為65.2 emu/g，隨著加入的磁性納米顆粒濃度的升高，磁性納米纖維的磁飽和度逐漸升高，2.5wt％時(shí)約為6.3emu/g，5wt％時(shí)為11.8 emu/g，10wt％時(shí)為19.2 emu/g。FTIR，XRD檢測顯示，磁性納米粒子在磁性納米纖維中的存在和晶體結(jié)構(gòu)良好。
　　磁性組裝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5層10wt％組磁性膜疊加，在不施加外在磁場時(shí)，層與層之間距離較

17、大，結(jié)構(gòu)松散，不穩(wěn)定。施加磁場后，受磁吸引力作用，多層膜迅速向磁場強(qiáng)的方向聚攏，緊緊貼附在玻璃片上，在磁場存在下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。并且可以在液體中實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)膜片的移動(dòng)操控。
　　將磁性膜種植于大鼠腹部皮下后，第三天可通過MRI成像清晰的看到支架材料在體內(nèi)的狀態(tài)。證明了進(jìn)行移植體示蹤和無創(chuàng)檢測的可能性。
　　細(xì)胞live/dead染色分析發(fā)現(xiàn)，種植第3天后，細(xì)胞在各比例的磁性膜上存活狀態(tài)良好，證明磁性膜具有良好的生物相容性。