載柚皮苷骨軟骨復合支架的構(gòu)建及其對兔骨軟骨缺損修復的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.構(gòu)建載柚皮苷骨軟骨復合支架，評價復合支架的相關(guān)性能；
　　2.載柚皮苷骨軟骨復合支架的軟骨層、骨層支架分別與BMSCs共培養(yǎng)，評價復合支架的生物相容性；
　　3.評價載柚皮苷骨軟骨復合支架對兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的體內(nèi)修復效果。
　　方法：
　　1.利用水包油包水相法制備載柚皮苷微球、無載柚皮苷微球；以柚皮苷作為軟骨細胞增殖的緩釋藥物，以TGF-β1作為軟骨細胞增殖的陽性對照劑，分別與Ⅰ型膠原采

2、用混合凍干法構(gòu)建軟骨層支架；以凹凸棒石與Ⅰ型膠原采用溶液澆鑄-粒子析出法構(gòu)建骨層支架；采用3層夾心法分別構(gòu)建無載柚皮苷骨軟骨復合支架、載柚皮苷骨軟骨復合支架、載TGF-β1骨軟骨復合支架。
　　2.肉眼及SEM觀察微球和骨軟骨復合支架的形貌。測定載柚皮苷微球的載藥率、包封率及體外藥物緩釋效能；測定骨軟骨復合支架中軟骨層、骨層支架的孔隙率、吸水膨脹率及載柚皮苷的軟骨層支架體外藥物緩釋效能。
　　3.BMSCs作為種子細胞，評價

3、載柚皮苷骨軟骨復合支架的生物相容性。采用SEM觀察軟骨層、骨層支架上BMSCs的黏附、生長情況；利用CCK-8法檢測BMSCs在軟骨層、骨層支架上增殖情況。
　　4.48只清潔級雄性日本大耳白兔隨機分為A、B、C、D四組，每組12只。于兔膝關(guān)節(jié)雙側(cè)股骨髁間窩處制備直徑4.5mm、深4mm的骨軟骨缺損模型，A組為缺損（空白對照）組，B、C、D組分別于骨軟骨缺損處植入無載柚皮苷骨軟骨復合支架（陰性對照組）、載柚皮苷骨軟骨復合支架（實驗

4、組）及載TGF-β1骨軟骨復合支架（陽性對照組）。
　　5.分別于術(shù)后3、6個月行320排動態(tài)容積CT檢測、處死兔取材，分別行大體觀察、Micro CT觀察、HE染色、甲苯胺藍染色和免疫組織化學染色，觀察骨軟骨缺損修復的效果；采用RT-PCR和Western blot方法分別檢測新生軟骨Ⅱ型膠原mRNA及蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.肉眼觀察載柚皮微球呈白色粉末狀，質(zhì)輕；SEM觀察微球呈規(guī)則的圓球狀，表面光滑，相

5、互間沒有黏連，粒徑約為5-50μm。載柚皮苷微球的載藥率為5.41％±0.02%、包封率為27.03%±0.07%。載柚皮苷微球的平均緩釋率為14.51%；載柚皮苷的軟骨層支架中藥物的平均釋放率為4.39%。
　　2.肉眼觀察骨軟骨復合支架呈白色，圓柱狀，直徑4.5mm，厚4mm，其中軟骨層支架厚2mm，骨層支架厚2mm。SEM顯示載柚皮苷復合支架結(jié)構(gòu)分層明顯，軟骨層支架與骨層支架黏接處緊密相連；軟骨層支架呈多孔片層結(jié)構(gòu)，排列無規(guī)

6、則且相互連通，微球均勻分散于支架中，其孔隙率大于95%，吸水膨脹率大于150%；骨層支架結(jié)構(gòu)致密，有大小不等的孔徑相通，孔徑為200-300μm。
　　3.載柚皮苷的軟骨層支架上細胞的增殖率與無載柚皮苷的軟骨層支架相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.兔體內(nèi)植入實驗大體觀察顯示，術(shù)后3個月C、D組缺損范圍與A、B組相比明顯縮??；術(shù)后6個月C組缺損處被新生軟骨所覆蓋，D組新生軟骨與周圍正常軟骨整合良好。Mi

7、cro CT結(jié)果顯示，術(shù)后6個月時A、B、C、D組間比較，軟骨下骨密度（BMD）表達量上無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。組織學染色結(jié)果顯示，術(shù)后3個月時，A組和B組缺損處被少量纖維組織填充，C組和D組可見少量軟骨生成；術(shù)后6個月時，C組和D組新生骨軟骨組織與正常骨軟骨類似，A組和B組缺損處以大量纖維組織為主。
　　5.RT-PCR檢測結(jié)果顯示，C組和D組缺損處新生組織中Ⅱ型膠原mRNA表達量與A組和B組相比均上調(diào)，其差異均有統(tǒng)計學意

8、義（P＜0.05），C組缺損處新生組織中II型膠原mRNA表達量與D組比較，其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯示，C組和D組缺損處新生組織中II型膠原蛋白的表達量與A組和B組比較上調(diào)，其差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），C組缺損處新生組織中II型膠原蛋白的表達量與D組比較，其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.構(gòu)建的載柚皮苷骨軟骨三層復合支架具有較高的孔隙率、吸水膨脹