β-TcP-pluronicF-127復(fù)合支架結(jié)合BMSCs修復(fù)兔關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、第一部分：凋亡相關(guān)基因在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)及意義
　　目的:研究骨關(guān)節(jié)炎中細(xì)胞凋亡情況，凋亡相關(guān)基因(FAS、BCL-2、caspases3)等在骨關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及意義，從而在一定程度闡明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理。
　　方法:通過Hulth法建立兔關(guān)節(jié)炎模型取得軟骨標(biāo)本，免疫組化S-P法檢測凋亡相關(guān)基因(FAS、BCL-2、caspases3)在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況，TUNEL法檢測骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡情況，并探討凋

2、亡相關(guān)基因(FAS、BCL-2、caspases3)的表達(dá)與軟骨細(xì)胞凋亡程度之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:術(shù)后8周時關(guān)節(jié)軟骨呈現(xiàn)典型的0A病理特征。實驗組和對照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)的差異具有顯著性(P<0.05);在軟骨細(xì)胞中FAS蛋白表達(dá)實驗組陽性率高于對照組，差異具有顯著性(P<0.05);實驗組關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞凋亡程度與FAS蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，差異具有顯著性(P<0.05)；在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中bcl-2蛋白的表達(dá)實驗組陽性率

3、低于對照組，但差異沒有顯著性(P>0.05);實驗組關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞凋亡程度與bcl-2蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異具有顯著性(P<0.05);caspase-3在實驗組的軟骨細(xì)胞陽性率高于對照組，差異具有顯著性(P<0.01);實驗組關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞凋亡程度與caspase3的表達(dá)呈正相關(guān)，差異具有顯著性(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Hulth法可制作較好的骨關(guān)節(jié)炎動物模型。
　　2.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡明顯

4、增加可能是關(guān)節(jié)炎形成的重要原因之一。
　　3.骨關(guān)節(jié)炎中FAS,BCL-2,caspase3等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與細(xì)胞凋亡程度具有明顯相關(guān)性，表明表達(dá)其與骨關(guān)節(jié)炎有密切關(guān)系。
　　第二部分兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)分化
　　目的:探索兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及體外誘導(dǎo)分化的方法，研究其體外增殖，分化能力。探討其作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性和應(yīng)用價值。
　　方法:采用密度梯度離心與

5、全骨髓培養(yǎng)結(jié)合的方法分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng);以流式細(xì)胞儀檢測BMSCs的表面抗原表達(dá);在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并繪制生長曲線;分別體外誘導(dǎo)第3代細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分化，對誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色、VonKossa染色和I型膠原和骨鈣素免疫組化染色檢測鑒定，對誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色、番紅O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測鑒定。
　　結(jié)果:經(jīng)密度梯度離心結(jié)合全骨髓培養(yǎng)法分離所得到的細(xì)胞形態(tài)均一

6、，呈長梭形或紡錘形。BMSCs增殖能力活躍,流式細(xì)胞儀檢測BMSCs顯示CD105,CD44,表達(dá)陽性，CD34和CD45表達(dá)為陰性。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可見堿性磷酸酶染色、VonKossa染色、I型膠原和骨鈣素免疫組化染色陽性;向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色、番紅0染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性。
　　結(jié)論:密度梯度分離法與全骨髓培養(yǎng)法結(jié)合能理想的分離、純化BMSCs;BMSCs在體外具有良好的增殖潛能，BMSCs在誘導(dǎo)劑

7、作用下能表現(xiàn)出成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性，是組織工程理想的種子細(xì)胞。
　　第三部分BMscs/β-TcP/pluronicF-127復(fù)合支架修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究
　　目的:研究β-TcP/pluronicF-127復(fù)合支架結(jié)合BMSCs修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損的效果，探討β-TcP/pluronicF-127復(fù)合支架做為組織工程支架承載BMSCs修復(fù)骨軟骨缺損的可行性。
　　方法:分離培養(yǎng)兔自體MSCs，將36

8、只健康新西蘭大白兔并隨機(jī)分為三組(A組、B組、C組)，于股骨髁關(guān)節(jié)面制備關(guān)節(jié)軟骨缺損模型(每孔直徑5mm、深度4-5mm)。A組、B組關(guān)節(jié)缺損處分別植入BMscs/β-TcP/pluronicF-127.、BMscs/β-TcP復(fù)合支架，C組為空白組不作處理。術(shù)后3、6個月分別取材，進(jìn)行缺損區(qū)組織學(xué)、組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)分析。A組、B組和正常關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)測試。
　　結(jié)果:A組能形成豐富的透明軟骨樣修復(fù)組織，與周圍組織整合

9、良好;B組以不成熟透明軟骨;C組無修復(fù)組織?？偟男迯?fù)效果A組最理想，C組最差。生物力學(xué)測試得出:B組和 C組標(biāo)本的蠕變時間和應(yīng)力松弛時候較正常關(guān)節(jié)均縮短，楊氏模量較正常關(guān)節(jié)偏小，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:BMSCs是良好的組織工程種子細(xì)胞，β-TcP/pluronicF-127復(fù)合支架是良好的生物工程支架,能承載BMSCs至缺損區(qū)修復(fù)骨軟骨缺損缺損，修復(fù)效果理想。BMscs/β-TcP/pluronicF-127復(fù)合支架材