RAMP1-siRNA對降鈣素基因相關(guān)肽促MG-63細(xì)胞增殖和分化作用影響的研究.pdf

1、五十多年前，降鈣素作為一種從甲狀旁腺中分泌出的降血鈣性的多肽激素被人們所發(fā)現(xiàn)。降鈣素是一個由32個氨基酸組成的縮氨酸，在位于1、7位點的半胱氨酸殘基及酰胺羧基末端由二硫鍵連接。降鈣素家族包含許多肽類激素，這些肽類激素大都與降鈣素在結(jié)構(gòu)上有很多相似性，代表性的的包括:降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、和促黑激素（腎上腺髓質(zhì)素）等多種激素。而其中作為神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的交叉分子CGRP，也是骨組織中分布最為廣泛的感覺神經(jīng)肽，在骨形成和骨改建中所

2、扮演的角色越來越受到廣泛的關(guān)注。
　　大量的實驗均已證實CGRP具有良好的生物學(xué)活性，尤其可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖以及分化，作用在成骨細(xì)胞表面受體即:降鈣素受體樣受體(CRLR)，受體活性修飾蛋白(RAMP1)和受體組分蛋白(RCP)來發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)RAMP1后能促進(jìn)CRLR的膜分布以及CGRP對MG-63細(xì)胞促分化作用。為了更加深入的了解CGRP受體功能及受體間關(guān)系，本實驗在前期工作

3、基礎(chǔ)上，首次利用RNA干擾技術(shù)探討干擾RAMP1表達(dá)后對CGRP受體及MG-63細(xì)胞生物學(xué)活性影響的研究，以期更深入的闡明RAMP1的受體功能以及神經(jīng)肽在骨創(chuàng)傷中的修復(fù)機(jī)制。
　　CGRP通過G蛋白偶聯(lián)受體執(zhí)行其功能。而目前被確認(rèn)的受體為:降鈣素受體樣受體(CRLR)，受體活性修飾蛋白(RAMP1)和受體組分蛋白(RCP)。其中CRLR的功能和配型嚴(yán)格的依賴于受體活性修飾蛋白1-3(RAMP1-3)。CRLR與RAMP1聯(lián)合形成了

4、CGRP受體。盡管研究的難點依然在試圖通過分子模型策略來揭示RAMP1的分子結(jié)構(gòu)特點，但目前RAMP1分子結(jié)構(gòu)乃至功能仍不為人所熟知。為了進(jìn)一步深入明確RAMP1功能，本項實驗通過構(gòu)建RAMP1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，觀察干擾RAMP1的表達(dá)后對CRLR、RCP表達(dá)量和膜分布的影響，探索干擾RAMP1對CGRP作用于MG-63生物學(xué)活性的影響。
　　方法:
　　1.MG63成骨樣細(xì)胞傳代培養(yǎng):MG63成骨樣細(xì)胞來自

5、于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，接種到100ml的培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)掖中（高糖DMEM含10％FBS）置于5％CO2孵箱中，傳代備用。
　　2.siRNA的設(shè)計和合成:根據(jù)Ambion siRNA軟件，針對人RAMP1 mRNA靶位通過生物轉(zhuǎn)錄方法合成3對siRNA序列，經(jīng)Blast確定3對siRNA的特異性。確定RAMP1-homo-185 sense:5c-CAUCACCUCUUCAUGACCATT-3c;antisense:5c-UG

6、GUCAUGAAGAGGUGAUGTT-3c為使用序列，由上海英俊公司合成制作。
　　3.實驗分組:體外轉(zhuǎn)錄合成法合成及篩選siRNA，轉(zhuǎn)染至傳代培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞分為:RAMP1干擾組、空載體組、空白對照組。
　　4.RAMP1干擾對MG-63成骨樣細(xì)胞細(xì)胞受體的影響:
　　4.1轉(zhuǎn)染RAMP1-siRNA后對CRLR、RCP表達(dá)的影響:成功轉(zhuǎn)染RAMP1-siRNA后，熒光定量PCR檢測RAMP1干擾組、空載體組

7、、空白對照組CRLR、RCP的相對表達(dá)量。
　　4.2對CRLR、RCP在MG63成骨樣細(xì)胞膜分布表達(dá)的影響:激光共聚焦免疫熒光法檢測RAMP1干擾組、空載體組、空白對照組CRLR、RCP在MG63細(xì)胞膜分布表達(dá)情況。
　　5.RAMP1干擾對CGRP促MG63成骨樣細(xì)胞增殖影響的研究:CCK-8法檢測在0、24、48、72、96 h時空白對照組、空載體組、RAMP1干擾組細(xì)胞增殖情況。
　　6.RAMP1干擾對CGR

8、P促MG63成骨樣細(xì)胞分化的影響:Elasa法檢測RAMP1干擾組、空載體組、空白對照組ALP活性表達(dá)情況;熒光定量PCR檢測空載體組、RAMP1干擾組、空白對照組相關(guān)成骨標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)。
　　7.統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)均以x±s表示， P＜0.05為具有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　1.siRNA序列的設(shè)計與篩選:
　　siRNA的設(shè)計和合成:根據(jù)Ambion siRNA軟件，針

9、對人RAMP1 mRNA靶位通過生物轉(zhuǎn)錄方法合成3對siRNA序列，經(jīng)Blast確定3對siRNA的特異性。用熒光定量PCR法對干擾序列進(jìn)行篩選，確定最佳干擾效果為使用序列。
　　2.轉(zhuǎn)染RAMP1-siRNA后對CRLR、RCP表達(dá)的影響:
　　成功轉(zhuǎn)染RAMP1-siRNA后，熒光定量PCR檢測CRLR的結(jié)果顯示，RAMP1干擾組、空載體組、空白對照組CRLR的相對表達(dá)量分別為1.00±0.06;2.05±0.36;2.

10、14±0.18;與其它兩組相比，RAMP1干擾組中CRLR mRNA的表達(dá)是顯著降低的(P＜0.05);而與此同時，RCP的mRNA表達(dá)是相對于對照組是明顯升高的(P＜0.01)。免疫熒光的結(jié)果同樣顯示相對于空載體組，RAMP1干擾組CRLR的綠色熒光是明顯減弱的，而RCP的紅色熒光是增強(qiáng)的。
　　3.RAMP1干擾對CGRP促MG63成骨樣細(xì)胞增殖及分化的影響:
　　3.1 CCK-8法測定細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后

11、的18h后，RAMP1干擾組的細(xì)胞增殖效率顯著低于與其他兩組(p＜0.05)18h、24h、36h、48h的測定結(jié)果與前面一致，說明當(dāng)抑制了RAMP1的表達(dá)，CGRP促MG63細(xì)胞的增殖效率也會明顯受到抑制。
　　3.2 RAMP1干擾后并用10-8 mol/L CGRP處理誘導(dǎo)MG63細(xì)胞3d后，成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。熒光定量PCR結(jié)果顯示RAMP1干擾組ALP、Colla1、Runx2、OCNmRNA相對表達(dá)量分別為1.0

12、±0.12;1.11±0.36;以及0.91±0.17;1.11±0.29;空載體組這些標(biāo)志物的相對表達(dá)量分別為1.74±0.153;1.40±0.10;1.95±0.25;1.27±0.12，RAMP1干擾組ALP、Colla1、Runx2、OCN的表達(dá)均顯著低于空載體組(P＜0.05)。其中，只有RAMP1干擾組BMP2的mRNA的相對表達(dá)量無顯著變化。(P＞0.05)。
　　3.3 RAMP1干擾后并用108 mol/L C

13、GRP處理誘導(dǎo)MG63成骨細(xì)胞3d后，Elasa法檢測ALP活性表達(dá)變化。結(jié)果顯示，RAMP1干擾組ALP活性為36.66±10.59，空載體組為84.33±15.53; RAMP1干擾組ALP活性也明顯低于空載體組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.RAMP1干擾減少了CRLR蛋白在MG-63成骨樣細(xì)胞膜上的表達(dá)但同時增加了RCP在膜上的分布。
　　2.RAMP1干擾會抑制CGRP促進(jìn)MG-63成骨樣細(xì)胞增殖的效