NGF調(diào)控CGRP表達(dá)促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖分化的實(shí)驗研究.pdf

1、目的：
　　口腔頜面部因為腫瘤或者外傷造成的骨創(chuàng)傷和組織缺損一直是臨床的難點(diǎn)。隨著中國社會的飛速發(fā)展，口腔頜面部交通傷逐年增多，同時現(xiàn)代戰(zhàn)爭中對于頜面部的防護(hù)不足，造成戰(zhàn)創(chuàng)傷中頜面部傷的發(fā)生率達(dá)全身傷10％以上。因此，創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的研究一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。
　　骨創(chuàng)傷修復(fù)和愈合經(jīng)歷血腫形成，血腫機(jī)化，纖維骨痂的形成等一系列過程，包括免疫系統(tǒng)的參與，血管的生成和改建，成骨細(xì)胞的生成和募集。是一個由多細(xì)胞和多生長因子參與

2、調(diào)控的復(fù)雜過程，在此過程中既有成骨細(xì)胞和成骨相關(guān)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的調(diào)控作用，也有其他細(xì)胞通過旁分泌途徑產(chǎn)生的各種激素和調(diào)節(jié)因子的作用。大量的實(shí)驗證明周圍神經(jīng)系統(tǒng)分泌的神經(jīng)肽類物質(zhì)在骨創(chuàng)傷修復(fù)中有著重要的生物學(xué)意義，降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)，因在骨創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮的至關(guān)重要的調(diào)控作用而受到廣泛關(guān)注。在體內(nèi)實(shí)驗中通過基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠證明的CGRP具有明顯的成骨正效應(yīng)

3、;體外實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)CGRP有促進(jìn)成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)增殖作用，因而CGRP成為骨創(chuàng)傷愈合研究中的熱點(diǎn)和主體。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)也參與到骨創(chuàng)傷的修復(fù)和重建中，其中神經(jīng)生長因子(nervegrowth factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(neurotrophic factor; neurotrophic factors，NTF)的重要成員，存在于骨形成細(xì)胞中，通過上調(diào)成骨細(xì)胞活性，引導(dǎo)神經(jīng)長入骨痂來促進(jìn)骨的愈合

4、。CGRP由神經(jīng)末梢釋放作用于靶細(xì)胞，而NGF由神經(jīng)靶細(xì)胞釋放，被神經(jīng)末梢攝取，兩者都具有明顯的促成骨效應(yīng)，兩者是否有相互之間的信號聯(lián)系和調(diào)節(jié)機(jī)制報道少見。
　　本實(shí)驗基于以上想法，體外培養(yǎng)成骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞，通過NGF干預(yù)MG-63細(xì)胞，檢測CGRP的表達(dá)狀況，探討NGF對骨修復(fù)過程中對CGRP的影響，以及對MG-63增殖和分化的作用，旨在加深對骨創(chuàng)傷愈合機(jī)制的認(rèn)識，為臨床頜骨骨創(chuàng)傷愈合治療方法提供相關(guān)理論依據(jù)。

5、>　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):
　　人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞株購買于ATCC公司，以8×106/瓶密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，加入含10％ FCS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于5％ CO2孵箱中37℃孵育48傳代，3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗。
　　2.NGF對MG-63細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用。
　　2.1.MG-63細(xì)胞增殖:ELISA法檢測NGF刺激MG-63細(xì)胞后CGRP表達(dá);Q-PCR法測CGRP m

6、RNA表達(dá);CCK-8法測MG-63細(xì)胞增殖。NGF濃度(0-100 ng/ml)，時效作用(1-4d)。
　　2.2.MG-63細(xì)胞分化:PNPP偶氮法檢測NGF對MG-63細(xì)胞ALP染色的調(diào)控作用(100 ng/ml);茜素紅染色檢測NGF對MG-63鈣化結(jié)節(jié)的量效作用(100 ng/ml)。
　　2.3.MG-63細(xì)胞中加入NGF受體阻斷劑(PD98059): Q-PCR法測CGRP mRNA表達(dá);CCK-8法測MG-

7、63細(xì)胞增殖。NGF濃度(0-100 ng/ml)，時效作用(1-4d)。
　　3.MG-63細(xì)胞過表達(dá)NGF對CGRP的表達(dá)作用，以及對成骨標(biāo)志物的表達(dá)作用。
　　MG-63細(xì)胞過表達(dá)NGF:RT-PCR，Western-blot檢測CGRP以及MG-63細(xì)胞中ALP、CollagenⅠ的表達(dá)。時效作用(1-5d)。
　　結(jié)果:
　　1.NGF對MG-63細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用。
　　1.1.MG-63細(xì)

8、胞增殖:ELISA檢測發(fā)現(xiàn)MG-63細(xì)胞自身可以產(chǎn)生少量的CGRP，在NGF作用下，可以明顯上調(diào)MG-63細(xì)胞分泌的CGRP(p＜0.05)，而且隨NGF濃度升高，CGRP有明顯的濃度依賴性。
　　MG-63細(xì)胞上清液中CGRP的濃度隨不同濃度的NGF作用時間延長也相應(yīng)增加(p＜0.05)。RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)在NGF作用下，可以明顯上調(diào)MG-63細(xì)胞分泌的CGRPmRNA(p＜0.05)，而且隨加入的NGF濃度升高，此作用也相

9、應(yīng)增強(qiáng)。此外，MG-63細(xì)胞總RNA中CGRPmRNA的濃度隨不同濃度的NGF作用時間延長也相應(yīng)增加(p＜0.05)。
　　CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)加入NGF阻斷劑后的干擾組的MG-63細(xì)胞增殖效率明顯低于其余兩組(p＜0.05)，而實(shí)驗組加入NGF刺激后MG-63細(xì)胞增殖效率明顯高于空白對照組(p＜0.05)，而且隨加入的NGF濃度升高，此作用也相應(yīng)增強(qiáng)。此外實(shí)驗組NG-63細(xì)胞增殖效率隨不同濃度的NGF作用時間延長也相應(yīng)增加(p＜

10、0.05)。
　　1.2.MG-63細(xì)胞分化:PNPP偶氮法檢測發(fā)現(xiàn)NGF刺激MG-63細(xì)胞的ALP表達(dá)量明顯高于空白對照組(p＜0.05);茜素紅染色檢測發(fā)現(xiàn)NGF刺激MG-63細(xì)胞茜素紅染色計數(shù)高于對照組（P＜0.05）。
　　1.3.MG-63細(xì)胞中加入NGF受體阻斷劑:RT-QPCR檢測發(fā)現(xiàn)在加入NGF阻斷劑后，可以明顯降低MG-63細(xì)胞分泌的CGRPmRNA(p＜0.05)，而且隨加入的NGF濃度升高，此作用也相應(yīng)

11、增強(qiáng)。此外在3d為NGF阻斷劑干擾時間的峰值(p＜0.05)。
　　2.MG-63細(xì)胞過表達(dá)NGF對CGRP的表達(dá)作用，以及對成骨標(biāo)志物的表達(dá)作用。
　　MG-63細(xì)胞過表達(dá)NGF:NGF過表達(dá)的慢病毒及空載體慢病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后Real-time PCR結(jié)果顯示ALP、CollagenⅠ和CGRP的mRNA濃度比空載體組明顯升高(p＜0.05），且隨著NGF作用時間延長也相應(yīng)增加(p＜0.05)。NGF過表達(dá)的慢病毒

12、及空載體慢病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后WB結(jié)果顯示ALP、CollagenⅠ和CGRP的表達(dá)量比空載體組顯著升高(p＜0.05），且隨著NGF作用時間延長也相應(yīng)增加(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.MG-63細(xì)胞自身可以產(chǎn)生少量的CGRP，在NGF作用下可以明顯上調(diào)MG-63細(xì)胞分泌的CGRP的表達(dá)量，而且隨NGF濃度升高，CGRP有明顯的濃度和時間依賴性。
　　2.通過對NGF的信號阻斷可以有效抑制CGRP的表達(dá)，