不同力學因素作用下人源MG-63成骨樣細胞差異基因表達的研究.pdf

1、成骨細胞是骨形成細胞，在新骨形成和舊骨吸收的穩(wěn)態(tài)平衡中具有十分重要的意義。適當應力刺激作用于成骨細胞后可通過多種信號轉導通路傳導至細胞內部，促使成骨細胞分泌多種生長因子、轉錄因子，從而影響成骨細胞生物學功能。目前已證實，流體剪切應力是成骨細胞和骨細胞在生理狀態(tài)下感受到的主要機械應力刺激。此外，重力作為一種場力，也可影響成骨細胞的功能。在航天飛行中的失重環(huán)境可導致航天員出現(xiàn)骨質丟失，主要原因就是失重所導致的成骨細胞功能下降，骨形成能力降低

2、。目前，應力和重力刺激對成骨細胞生物學功能影響的研究多集中在某個或者某些已知與成骨細胞功能密切相關的分子物質，但基因水平的變化機制尚不明確?；蛐酒夹g將探針分子密集固定于支持物表面后與預先標記熒光染料的樣品（蛋白質、cDNA等）進行雜交，通過測量探針的熒光強度從而獲得樣品的表達情況和序列信息。因此，利用基因芯片研究應力和重力等力學因素調控成骨細胞生物學功能的分子類型，對探索失重性骨質丟失的細胞生物學機制，尋找對抗失重性骨質丟失的分子靶

3、點，開發(fā)新型對抗措施具有重要意義。
　　本課題針對流體剪切應力和重力兩種力學因素作用下成骨細胞基因表達譜的變化開展研究工作。通過基因芯片技術，分別檢測了流體剪切應力作用后人源MG-63成骨樣細胞基因表達譜的變化，回轉器模擬失重后MG-63細胞基因表達譜的變化，并選擇在兩種應力變化下均顯著差異表達的基因ESM1，進一步探討了ESM1對成骨細胞生物學功能的影響。具體實驗結果如下：
　　一、流體剪切應力作用后MG-63細胞差異基因

4、研究
　　MG-63細胞以適當密度（1×105個/孔）接種于載玻片（25.5×21.5mm），于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)72h。將細胞隨機分為剪切應力組和正常對照組。剪切應力組移至流體剪切系統(tǒng)中給予符合在體生理范圍的流體剪切應力刺激（1.5 Pa,60min）。正常對照組細胞給予除流體剪切應力作用外的相同處理。處理結束后分別提取兩組總RNA，對RNA進行質檢，合格后進行Affymetrix基因芯片雜交掃描，并對芯片結果進行生物信息學分析。

5、
　　經過芯片掃描，發(fā)現(xiàn)剪切應力組與正常對照組相比，有6223個基因發(fā)生了改變，其中表達上調基因2554個，表達下調基因3669個。Gene ontology注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與細胞的轉錄調控、細胞內信號級聯(lián)響應、細胞凋亡調控和細胞增殖等功能調控。Pathway富集注釋分析還發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要參與了 MAPK信號通路、TGF-β信號通路、P53信號轉導通路、Focal adhesion信號轉導通路和Wnt信號轉導通路的

6、信號調控。在上調和下調表達變化倍數最大的各10個差異基因中，15個基因尚未見在成骨細胞中開展過研究報道。
　　二、模擬失重后MG-63細胞差異基因研究
　　MG-63細胞以適當密度（1×105個/孔）接種于載玻片（25.5×21.5mm），于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)72h。將細胞隨機分為模擬失重組和正常對照組。模擬失重組置于2D-RWVs型雙向多樣本回轉器中回轉，回轉速度24rpm，作用時間48h。正常對照組細胞在回轉艙中靜置相同時

7、間。處理結束后分別提取兩組的總RNA，質檢合格后進行Affymetrix基因芯片雜交掃描，并對芯片結果進行生物信息學分析。
　　基因芯片掃描結果發(fā)現(xiàn)，模擬失重組與正常對照組相比，197個基因發(fā)生了改變，其中表達上調基因151個，表達下調基因46個。Gene ontology注釋分析發(fā)現(xiàn)，表達上調基因主要參與細胞生物合成進程的負性調控和細胞死亡的調控等功能調控。表達下調基因主要參與細胞骨架聯(lián)接、細胞大分子物質代謝等細胞組分和功能調控

8、。差異表達基因翻譯蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS、FOSB、STAT3和HBEGF等差異表達基因的蛋白產物與其他差異表達基因蛋白產物相互作用關系緊密。在上調和下調表達變化倍數最大的各10個差異基因中，13個基因尚未見在成骨細胞中開展過研究報道。
　　三、模擬失重后差異表達基因ESM1對成骨細胞生物學功能的影響
　　流體剪切應力和模擬失重后的基因芯片結果中，均顯示ESM1發(fā)生顯著性差異性表達。為此，我們對ESM1在成骨細胞生物學

9、功能中的作用進行了驗證性研究。首先，使用實時熒光定量PCR技術驗證回轉器模擬失重后MG-63細胞中ESM1基因的表達變化；其次，通過轉染siRNA抑制ESM1基因表達，觀察MG-63細胞增殖、分化、礦化能力的變化。
　　結果證實，在模擬失重后ESM1的基因表達顯著上調。通過轉染siRNA沉默ESM1表達后，MG-63細胞增殖能力顯著增強，表明ESM1對MG-63細胞的增殖有負性調控作用；抑制ESM1表達后，MG-63細胞分化標志物

10、ALP、RUNX2表達量顯著下降，表明ESM1對MG-63細胞的分化有正性調控作用；抑制ESM1表達后，茜素紅染色表明細胞礦化能力顯著增強，表明ESM1對MG-63細胞的礦化有負性調控作用。
　　綜上所述，流體剪切應力和模擬失重作用后人源MG-63成骨樣細胞的基因表達譜發(fā)生了顯著改變。差異表達基因廣泛參與細胞的分子功能、細胞組分、生物學途徑和信號通路調控。同時，在高倍數差異表達的基因中，較多基因在成骨細胞功能調控中的作用尚不明確。