EMPs作用下人牙齦上皮細(xì)胞及牙周膜細(xì)胞基因表達(dá)差異研究.pdf

1、牙周組織再生一直是牙周病治療領(lǐng)域追求的目標(biāo)，理想的牙周組織再生需達(dá)到以下要求：1)重建功能性上皮封閉；2)新的Sharpey氏纖維插入重建功能性牙周膜；3)暴露根面上形成新的無(wú)細(xì)胞性牙骨質(zhì)；4)牙槽骨高度恢復(fù)到距釉牙骨質(zhì)界2mm以?xún)?nèi)。但由于對(duì)牙周組織再生機(jī)理認(rèn)識(shí)還不完全清楚，導(dǎo)致目前牙周組織再生還不能完全達(dá)到上述要求。 近年發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白(EnamelMatrixProteins，EMPs)也可以促進(jìn)牙周組織再生，它可誘導(dǎo)出無(wú)細(xì)

2、胞性牙骨質(zhì)和生理性排列的牙周韌帶，且很少伴隨有長(zhǎng)上皮結(jié)合。牙周組織再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)就在于如何促使牙周膜細(xì)胞優(yōu)先占據(jù)缺損區(qū)、抑制牙齦上皮細(xì)胞的過(guò)度增殖。EMPs促進(jìn)牙周組織再生可能遵循這一細(xì)胞學(xué)機(jī)制。但它作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如何發(fā)揮這種作用還不清楚。對(duì)此進(jìn)行深入研究，不僅有助于我們深入了解牙周組織再生的潛在機(jī)制，也能夠指導(dǎo)臨床應(yīng)用，而且有希望開(kāi)發(fā)出新的效果更好的牙周缺損治療技術(shù)。 本課題以?xún)煞N與牙周組織再生密切相關(guān)的細(xì)胞(牙周

3、膜細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞)為研究對(duì)象，從基因水平初步分析EMPs對(duì)它們發(fā)揮不同生物學(xué)作用的機(jī)理。通過(guò)本課題的研究，不僅可能發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)EMPs對(duì)細(xì)胞增殖發(fā)生影響的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和關(guān)鍵基因、為進(jìn)一步研究EMPs如何促進(jìn)牙周組織再生打下基礎(chǔ)；而且可能發(fā)現(xiàn)參與牙周組織再生的因子。本課題分為兩部分。 第一部分EMPs對(duì)人牙齦上皮細(xì)胞抑制作用的基因表達(dá)差異分析本部分主要研究了EMPs對(duì)人牙齦上皮細(xì)胞(HumanGingivalEpithelia

4、lCells，hGECs)的生物學(xué)作用，據(jù)此選擇合適的EMPs濃度和檢測(cè)時(shí)間，使用基因芯片分析EMPs作用下hGECs基因表達(dá)差異，并通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)這些差異基因進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)一EMPs對(duì)人牙齦上皮細(xì)胞的抑制作用本實(shí)驗(yàn)主要觀(guān)察了EMPs對(duì)hGECs的生物學(xué)作用。首先解決了原代培養(yǎng)hGECs過(guò)程中細(xì)胞很快老化的問(wèn)題，能夠獲得足量細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證明ESPs對(duì)hGECs增殖具有抑制作用，200mg/L濃度抑制增殖的

5、作用最強(qiáng)，可以使細(xì)胞倍增時(shí)間從48h左右延長(zhǎng)至80h左右，經(jīng)流式細(xì)胞分析，此濃度下EMPs作用48h可以使hGECs靜息在G1期，但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，透射電子顯微鏡觀(guān)察可以發(fā)現(xiàn)在EMPs作用下，hGECs的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一些與細(xì)胞抑制相一致的改變。 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)EMPs對(duì)hGECs增殖有明顯的抑制作用，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇了合適的EMPs濃度和作用時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)二EMPs作用下人牙齦上皮細(xì)胞基因差異表達(dá)的基因芯片分析本實(shí)驗(yàn)選用

6、Agilent公司生產(chǎn)的22K人類(lèi)全基因組芯片，分析了在EMPs作用下hGECs基因差異表達(dá)情況。Agilent公司開(kāi)發(fā)的這種寡核苷酸芯片，采用60mer探針和雙色熒光標(biāo)記，能夠通過(guò)一張芯片分析出兩個(gè)樣本基因差異表達(dá)情況，并且具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。按照Agilent公司標(biāo)準(zhǔn)化分析流程，本實(shí)驗(yàn)獲得上調(diào)基因227個(gè)，下調(diào)基因409個(gè)。 實(shí)驗(yàn)三EMPs作用下人牙齦上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因歸類(lèi)及通路分析本實(shí)驗(yàn)主要采用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得

7、的差異基因進(jìn)行分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索去除重復(fù)基因，EMPs作用下hGECs表達(dá)上調(diào)的基因?qū)嶋H有223條，下調(diào)基因?qū)嶋H有375條。 通過(guò)Onto-Express平臺(tái)、根據(jù)GeneOntology數(shù)據(jù)庫(kù)將這些差異表達(dá)基因歸為24類(lèi)，這些基因涵蓋了細(xì)胞的整個(gè)生理過(guò)程，其中與細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等相關(guān)的基因占了較大比例，而且主要表現(xiàn)為下調(diào)，提示EMPs主要影響細(xì)胞代謝及增殖過(guò)程，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在這些過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用，

8、從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用?；蚬δ芊治霰砻鳎瑓⑴c細(xì)胞增殖的基因中有很多也具有細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能，顯示細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的緊密聯(lián)系。EMPs上調(diào)的基因大都具有抑制增殖作用(如SCGB3A1、MDM2、VHL等)，下調(diào)基因大都是一些可以促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、使細(xì)胞增殖的基因(如MYC、NAP1L1、WDR39、AREG、PBEF、TACSTD2等)，這些基因所發(fā)揮的功能較好的解釋了本部分實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果。其中比較關(guān)鍵的基因是：MYC、RB1、IFI16

9、、CDKN3、INHBA、MDM2、AREG等，這些基因?qū)1/S期起重要的調(diào)控作用，可能在使細(xì)胞靜息在G1期、抑制細(xì)胞增殖過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。 通過(guò)Onto-Pathway平臺(tái)、根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出9條EMPs作用下hGECs差異表達(dá)基因參與的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路代表了hGECs對(duì)EMPs的信號(hào)反應(yīng)過(guò)程。其中比較關(guān)鍵的可能是TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因?yàn)檫@些通路可以

10、傳遞外界刺激信號(hào)，對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期有重要的調(diào)控作用，而且對(duì)其它信號(hào)通路也可以通過(guò)某些信號(hào)分子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 第二部分EMPs對(duì)人牙周膜細(xì)胞促增殖作用的基因差異表達(dá)分析本部分實(shí)驗(yàn)首先觀(guān)察了EMPs對(duì)hPDLCs增殖和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示EMPs可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、提高細(xì)胞增殖指數(shù)。根據(jù)這些結(jié)果選擇合適的EMPs作用時(shí)間(48h)用于基因芯片檢測(cè)，獲得上調(diào)基因129條、下調(diào)基因45條。 對(duì)這些基因進(jìn)行功能分類(lèi)和功能分析

11、表明，EMPs可以促進(jìn)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、提高細(xì)胞代謝水平。許多差異表達(dá)基因都與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖密切相關(guān)，上調(diào)的基因能夠?qū)?xì)胞增殖起到促進(jìn)作用(如MKI67、CSE1L、ASPM、RCC1、RAD21、PBK等)，下調(diào)基因?qū)?xì)胞增殖有負(fù)向調(diào)節(jié)功能(如FTH1)，同時(shí)EMPs還使細(xì)胞表達(dá)一些抗凋亡基因(如PDCD6IP、AMIGO2等)，從而總體上增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF在促進(jìn)hPDLCs增殖過(guò)程中可能也起重

12、要作用。 信號(hào)通路分析表明，有5條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了hPDLCs對(duì)EMPs的反應(yīng)過(guò)程。這些信號(hào)通路與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，同時(shí)也參與hGECs對(duì)EMPs的信號(hào)反應(yīng)過(guò)程，所不同的是參與調(diào)節(jié)的基因及其表達(dá)情況，提示這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)過(guò)程中的關(guān)鍵作用。另外一些僅參與EMPs對(duì)hGECs抑制作用的信號(hào)通路(凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Jak-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)，可能在調(diào)節(jié)EMPs對(duì)hPDLCs和hGECs的

13、不同作用過(guò)程中有重要意義。 通過(guò)本課題的研究，可以得出以下結(jié)論：1.EMPs可以在促進(jìn)hPDLCs增殖的同時(shí)抑制hGECs增殖。這可能是EMPs促進(jìn)牙周組織再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 2.EMPs通過(guò)調(diào)節(jié)不同基因的表達(dá)，影響hGECs和hPDLCs的生物學(xué)行為，這些復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是EMPs對(duì)這兩類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生不同生物學(xué)作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。 3.有些基因由于其在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期過(guò)程中的重要功能而起關(guān)鍵作用。EMPs抑

14、制hGECs增殖的關(guān)鍵基因可能是MYC、RB1、IFI16、CDKN3、INHBA、MDM2、AREG等，促進(jìn)hPDLCs增殖的關(guān)鍵基因可能是MKI67、CSE1L、TGFBI、ASPM、RCC1、PBK等。 4.發(fā)現(xiàn)EMPs可上調(diào)hPDLCs神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF基因轉(zhuǎn)錄，提示EMPs可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自分泌這一生長(zhǎng)因子，參與細(xì)胞增殖。 5.EMPs通過(guò)相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)hPDLCs和hGECs的增殖過(guò)程產(chǎn)生影響，顯示這