EMPs作用下人牙齦上皮細胞及牙周膜細胞基因表達差異研究.pdf

1、牙周組織再生一直是牙周病治療領(lǐng)域追求的目標，理想的牙周組織再生需達到以下要求：1)重建功能性上皮封閉；2)新的Sharpey氏纖維插入重建功能性牙周膜；3)暴露根面上形成新的無細胞性牙骨質(zhì)；4)牙槽骨高度恢復到距釉牙骨質(zhì)界2mm以內(nèi)。但由于對牙周組織再生機理認識還不完全清楚，導致目前牙周組織再生還不能完全達到上述要求。 近年發(fā)現(xiàn)釉基質(zhì)蛋白(EnamelMatrixProteins，EMPs)也可以促進牙周組織再生，它可誘導出無細

2、胞性牙骨質(zhì)和生理性排列的牙周韌帶，且很少伴隨有長上皮結(jié)合。牙周組織再生的細胞學基礎(chǔ)就在于如何促使牙周膜細胞優(yōu)先占據(jù)缺損區(qū)、抑制牙齦上皮細胞的過度增殖。EMPs促進牙周組織再生可能遵循這一細胞學機制。但它作為一種細胞外基質(zhì)蛋白，如何發(fā)揮這種作用還不清楚。對此進行深入研究，不僅有助于我們深入了解牙周組織再生的潛在機制，也能夠指導臨床應用，而且有希望開發(fā)出新的效果更好的牙周缺損治療技術(shù)。 本課題以兩種與牙周組織再生密切相關(guān)的細胞(牙周

3、膜細胞和牙齦上皮細胞)為研究對象，從基因水平初步分析EMPs對它們發(fā)揮不同生物學作用的機理。通過本課題的研究，不僅可能發(fā)現(xiàn)介導EMPs對細胞增殖發(fā)生影響的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導通路和關(guān)鍵基因、為進一步研究EMPs如何促進牙周組織再生打下基礎(chǔ)；而且可能發(fā)現(xiàn)參與牙周組織再生的因子。本課題分為兩部分。 第一部分EMPs對人牙齦上皮細胞抑制作用的基因表達差異分析本部分主要研究了EMPs對人牙齦上皮細胞(HumanGingivalEpithelia

4、lCells，hGECs)的生物學作用，據(jù)此選擇合適的EMPs濃度和檢測時間，使用基因芯片分析EMPs作用下hGECs基因表達差異，并通過生物信息學方法對這些差異基因進行分析。 實驗一EMPs對人牙齦上皮細胞的抑制作用本實驗主要觀察了EMPs對hGECs的生物學作用。首先解決了原代培養(yǎng)hGECs過程中細胞很快老化的問題，能夠獲得足量細胞用于實驗。通過MTT實驗證明ESPs對hGECs增殖具有抑制作用，200mg/L濃度抑制增殖的

5、作用最強，可以使細胞倍增時間從48h左右延長至80h左右，經(jīng)流式細胞分析，此濃度下EMPs作用48h可以使hGECs靜息在G1期，但對細胞凋亡無明顯影響，透射電子顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)在EMPs作用下，hGECs的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一些與細胞抑制相一致的改變。 本實驗證實EMPs對hGECs增殖有明顯的抑制作用，并為后續(xù)實驗選擇了合適的EMPs濃度和作用時間。 實驗二EMPs作用下人牙齦上皮細胞基因差異表達的基因芯片分析本實驗選用

6、Agilent公司生產(chǎn)的22K人類全基因組芯片，分析了在EMPs作用下hGECs基因差異表達情況。Agilent公司開發(fā)的這種寡核苷酸芯片，采用60mer探針和雙色熒光標記，能夠通過一張芯片分析出兩個樣本基因差異表達情況，并且具有較高的特異性和準確性。按照Agilent公司標準化分析流程，本實驗獲得上調(diào)基因227個，下調(diào)基因409個。 實驗三EMPs作用下人牙齦上皮細胞差異表達基因歸類及通路分析本實驗主要采用生物信息學方法對獲得

7、的差異基因進行分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索去除重復基因，EMPs作用下hGECs表達上調(diào)的基因?qū)嶋H有223條，下調(diào)基因?qū)嶋H有375條。 通過Onto-Express平臺、根據(jù)GeneOntology數(shù)據(jù)庫將這些差異表達基因歸為24類，這些基因涵蓋了細胞的整個生理過程，其中與細胞代謝、信號轉(zhuǎn)導、細胞增殖、細胞周期等相關(guān)的基因占了較大比例，而且主要表現(xiàn)為下調(diào)，提示EMPs主要影響細胞代謝及增殖過程，信號轉(zhuǎn)導可能在這些過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，

8、從而對細胞產(chǎn)生抑制作用。基因功能分析表明，參與細胞增殖的基因中有很多也具有細胞周期調(diào)節(jié)功能，顯示細胞增殖與細胞周期的緊密聯(lián)系。EMPs上調(diào)的基因大都具有抑制增殖作用(如SCGB3A1、MDM2、VHL等)，下調(diào)基因大都是一些可以促進細胞有絲分裂、使細胞增殖的基因(如MYC、NAP1L1、WDR39、AREG、PBEF、TACSTD2等)，這些基因所發(fā)揮的功能較好的解釋了本部分實驗一的結(jié)果。其中比較關(guān)鍵的基因是：MYC、RB1、IFI16

9、、CDKN3、INHBA、MDM2、AREG等，這些基因?qū)1/S期起重要的調(diào)控作用，可能在使細胞靜息在G1期、抑制細胞增殖過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。 通過Onto-Pathway平臺、根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，篩選出9條EMPs作用下hGECs差異表達基因參與的細胞信號轉(zhuǎn)導通路，這些信號轉(zhuǎn)導通路代表了hGECs對EMPs的信號反應過程。其中比較關(guān)鍵的可能是TGFβ信號轉(zhuǎn)導通路、MAPK信號轉(zhuǎn)導通路、鈣離子信號轉(zhuǎn)導通路，因為這些通路可以

10、傳遞外界刺激信號，對細胞增殖、細胞周期有重要的調(diào)控作用，而且對其它信號通路也可以通過某些信號分子發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 第二部分EMPs對人牙周膜細胞促增殖作用的基因差異表達分析本部分實驗首先觀察了EMPs對hPDLCs增殖和細胞周期的影響，結(jié)果顯示EMPs可以促進細胞增殖、提高細胞增殖指數(shù)。根據(jù)這些結(jié)果選擇合適的EMPs作用時間(48h)用于基因芯片檢測，獲得上調(diào)基因129條、下調(diào)基因45條。 對這些基因進行功能分類和功能分析

11、表明，EMPs可以促進細胞基因轉(zhuǎn)錄、提高細胞代謝水平。許多差異表達基因都與細胞周期和細胞增殖密切相關(guān)，上調(diào)的基因能夠?qū)毎鲋称鸬酱龠M作用(如MKI67、CSE1L、ASPM、RCC1、RAD21、PBK等)，下調(diào)基因?qū)毎鲋秤胸撓蛘{(diào)節(jié)功能(如FTH1)，同時EMPs還使細胞表達一些抗凋亡基因(如PDCD6IP、AMIGO2等)，從而總體上增強細胞的增殖能力。另外，本實驗還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子BDNF在促進hPDLCs增殖過程中可能也起重

12、要作用。 信號通路分析表明，有5條信號轉(zhuǎn)導通路介導了hPDLCs對EMPs的反應過程。這些信號通路與細胞增殖密切相關(guān)，同時也參與hGECs對EMPs的信號反應過程，所不同的是參與調(diào)節(jié)的基因及其表達情況，提示這些信號轉(zhuǎn)導通路在細胞增殖調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵作用。另外一些僅參與EMPs對hGECs抑制作用的信號通路(凋亡信號轉(zhuǎn)導通路、Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導通路、Jak-STAT信號轉(zhuǎn)導通路)，可能在調(diào)節(jié)EMPs對hPDLCs和hGECs的

13、不同作用過程中有重要意義。 通過本課題的研究，可以得出以下結(jié)論：1.EMPs可以在促進hPDLCs增殖的同時抑制hGECs增殖。這可能是EMPs促進牙周組織再生的細胞學基礎(chǔ)。 2.EMPs通過調(diào)節(jié)不同基因的表達，影響hGECs和hPDLCs的生物學行為，這些復雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡，是EMPs對這兩類細胞產(chǎn)生不同生物學作用的分子生物學基礎(chǔ)。 3.有些基因由于其在細胞增殖和細胞周期過程中的重要功能而起關(guān)鍵作用。EMPs抑

14、制hGECs增殖的關(guān)鍵基因可能是MYC、RB1、IFI16、CDKN3、INHBA、MDM2、AREG等，促進hPDLCs增殖的關(guān)鍵基因可能是MKI67、CSE1L、TGFBI、ASPM、RCC1、PBK等。 4.發(fā)現(xiàn)EMPs可上調(diào)hPDLCs神經(jīng)生長因子BDNF基因轉(zhuǎn)錄，提示EMPs可能通過促進細胞自分泌這一生長因子，參與細胞增殖。 5.EMPs通過相似的信號轉(zhuǎn)導通路對hPDLCs和hGECs的增殖過程產(chǎn)生影響，顯示這