17β-雌二醇對人成骨樣MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1 mRNA表達的作用.pdf

1、17β-雌二醇對人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1mRNA表達的作用絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥((postmenopausalosteoporosis，PMOP)已成為嚴重威脅老年婦女身體健康的常見疾病，雌激素缺乏是其根本病因，但具體發(fā)病機制尚未闡明。為進一步探討PMOP的發(fā)病機制和雌激素的作用機制，早期篩查骨質(zhì)疏松的易感人群，分離和鑒定雌激素相關(guān)基因顯得非常重要。至今尚未見雌激素誘導成骨細胞基因表達譜變化的系列研究報道

2、。我們首次選擇具有成人成骨細胞表型特征的人成骨肉瘤MG-63細胞作為細胞模型，17β雌二醇(17β-estradiol，E2)干預(yù)后，采用cDNA代表性差異分析法(cDNArepresentationaldifferenceanalysis，cDNARDA)聯(lián)合cDNA陣列點雜交篩查雌激素相關(guān)基因表達譜。研究顯示，受雌激素誘導表達上調(diào)的基因與能量供應(yīng)、類固醇類激素代謝、基因轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等相關(guān)，受雌激素誘導表達下調(diào)的

3、基因與骨基質(zhì)形成、轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導及細胞分化發(fā)育調(diào)節(jié)等相關(guān)。其中，結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)受雌激素誘導后表達下調(diào)，多聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用蛋白-1(polyadenylate-bindingproteininteractingprotein1，PAIP-1)受雌激素誘導后表達上調(diào)。 CTGF是一個高度保守的肽類家族——CCN家族中的成員，參與了體內(nèi)的多種生理和病理過程，

4、尤其在TGF-β依賴性的纖維化途徑中發(fā)揮重要作用。在生理狀態(tài)下，CTGF可調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的形成以及蛋白水解酶和蛋白酶抑制劑的合成。PAIP-1可通過促進PABP介導的翻譯過程，從而在翻譯水平上的基因表達調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。但目前尚不明了CTGF、PAIP-1是否參與了雌激素介導的骨代謝調(diào)控作用。為進一步探討CTGF和PAIP-1在成骨細胞的表達情況以及是否受雌激素的調(diào)控，我們采用半定量RT-PCR和Northernbloting方法觀

5、察這些基因在人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞的表達變化，以及E2干預(yù)后對其表達水平的影響。 本研究的發(fā)現(xiàn)和結(jié)論：(1)人成骨肉瘤MG-63細胞和體外培養(yǎng)成人成骨細胞增殖分化不同階段均表達CTGF和PAIP-1mRNA。(2)17β-E2可劑量依賴性下調(diào)1人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGFmRNA的表達，而且，在成骨細胞這種下調(diào)作用具有明顯的時間依賴性，于12～24h下調(diào)作用最明顯。(3)E2下調(diào)人成骨肉瘤MG-

6、63和成骨細胞CTGFmRNA的表達的作用不是通過經(jīng)典的核受體途徑介導的，這為我們進一步研究雌激素對CTGF調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導機制以及CTGF在骨代謝中作用，提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。 Wnt誘導分泌蛋白(Wnt-induciblesecretedproteins,WISP3)也是CCN家族中的成員之一，與晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進行性骨關(guān)節(jié)病(spondyloepiphysealsdysplasiatardawithprogres

7、sivearthropathy，SEDT-PA)的發(fā)病密切相關(guān)。SEDT-PA，又稱為兒童進行性假類風濕性關(guān)節(jié)病或進行性假類風濕性骨發(fā)育不良，是一種主要累及軟骨組織的常染色體隱性遺傳性疾病。1983年由Spranger等首先報道，臨床上甚為罕見。我們收集到一個SEDT-PA家系，對其可能致病基因進行了序列篩查。研究發(fā)現(xiàn)，兩名患者的WISP3基因外顯子8出現(xiàn)復合雜合性基因突變，一條來自父方，在WISP3第334位密碼子首位堿基出現(xiàn)T到C的

8、錯義突變(1000T→C)；另一條來自母方，在WISP3第280位密碼子的末位堿基出現(xiàn)缺失突變(840delT)。這表明中國人的SEDT-PA發(fā)病與WISP3基因突變密切相關(guān)。 第一部分雌二醇誘導人成骨樣MG-63細胞差異表達基因的分離和鑒定 目的篩查E2誘導人成骨肉瘤MG-63細胞株差異表達cDNA片段，尋找人成骨肉瘤MG-63細胞中雌激素相關(guān)基因。 方法改良的cDNA代表性差異分析法分離E2干預(yù)人成骨肉瘤MG

9、-63細胞株表達上調(diào)和下調(diào)的cDNA片段。Southern雜交證實其來源后，制備陣列膜行斑點雜交，然后挑取陽性差異表達cDNA克隆測序并行同源比較分析。結(jié)果(1)經(jīng)過4輪消減雜交和動力性富集后分別得到3個E2誘導人成骨肉瘤MG-63細胞表達上調(diào)的cDNA條帶和2個E2誘導人成骨肉瘤MG-63細胞表達下調(diào)的cDNA條帶；(2)點雜交篩查得到120個差異表達陽性cDNA克隆，分別選20個表達上調(diào)和20個表達下調(diào)克隆測序，共得到36個序列，其

10、中表達上調(diào)者有17個序列，表達下調(diào)者19個序列。17個表達上調(diào)序列分別代表13個不同的基因，其中8個與己知基因同源，5個序列未比到同源序列，可能為新基因；19個表達下調(diào)序列分別代表14個不同基因，均與已知基因高度同源。結(jié)論cDNA代表性差異分析法能有效篩查差異表達cDNA片段，聯(lián)合cDNA陣列點雜交方法可快速高通量篩查差異表達基因。E2誘導人成骨肉瘤MG-63細胞中與骨基質(zhì)組成、能量供應(yīng)、類固醇類激素代謝、基因轉(zhuǎn)錄、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等

11、相關(guān)基因差別表達，可能從分子水平提供一些關(guān)于雌激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中所起保護作用的新依據(jù)。 第二部分人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1mRNA的表達目的觀察人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1mRNA的表達。 方法VanGieson法1型膠原染色，0.1％茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色；半定量RT-PCR檢測人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞堿性磷酸酶(alkalineph

12、osphatase，ALP)、骨鈣素(boneglaprotein，BGP)和1型膠原mRNA的表達以及CTGF和PAIP-1mRNA的表達。 結(jié)果確定人成骨肉瘤MG-63細胞和體外培養(yǎng)成人成骨細胞增殖分化的三個階段，即細胞增殖階段(MG-63細胞：0～9d，成骨細胞：0～11d)、基質(zhì)成熟階段(MG-63細胞：7～18d，成骨細胞：7～15d)和骨基質(zhì)礦化階段(MG-63細胞：17～18d后，成骨細胞：15d后)；人成骨肉瘤M

13、G-63細胞和成人成骨細胞均檢測到CTGF和PAIP-1mRNA的表達。 結(jié)論不同增殖分化階段的人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞均檢測到CTGF和PAIP-1mRNA的表達。 第三部分17β-雌二醇對人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1mRNA表達的作用目的觀察E2對人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1mRNA表達的影響。 方法用半定量RT-PCR和North

14、ernbloting方法檢測在不同劑量和不同時間下E2對人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGF和PAIP-1mRNA表達的影響。 結(jié)果10-8和10-6E2均明顯下調(diào)人成骨肉瘤MG-63細胞CTGFmRNA的表達，10-100E2對人成骨肉瘤MG-63細胞CTGFmRNA下調(diào)作用不明顯，無時間依賴關(guān)系；10-10、10-8和10-6E2均明顯下調(diào)成人成骨細胞CTGFmRNA的表達，呈時間依賴關(guān)系，以10-8E2作用12～

15、24下調(diào)作用最明顯。E2對人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞PAIP-1mRNA的表達無明顯影響。 結(jié)論E2可下調(diào)人成骨肉瘤MG-63細胞和成人成骨細胞CTGFmRNA的表達，且呈時間、劑量依賴性下調(diào)成人成骨細胞CTGFmRNA的表達；但對PAIP-1mRNA的表達無明確作用。 第四部分晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進行性骨關(guān)節(jié)病患者致病突變基因的篩查目的WISP3也是CCN家族中的成員之一，與SEDT-PA的發(fā)病密切相關(guān)

16、。我們收集到一個SEDT-PA家系，對其分子病因進行探討。 方法采用PCR擴增SEDT-PA可能的致病候選基因WISP3(CCN6)1～8外顯子以及Ⅲ、Ⅹ、Ⅺ型膠原基因的部分外顯子，ABIPRISMBigDyeTerminator循環(huán)測序試劑盒及ABIPRISMTM377XL自動DNA測序儀進行測序，以確定基因突變位點；采用PCR-RFLP技術(shù)對其家系和正常人群進行基因突變頻率的檢測。 結(jié)果兩名患者的WISP3基因外顯子

17、8出現(xiàn)復合雜合性基因突變，一個來自父方，在WISP3第334位密碼子首位堿基出現(xiàn)T到C的錯義突變(1000T→C)，并在其家系其他4個成員中發(fā)現(xiàn)該突變位點的攜帶者；另一個來自母方，在WISP3第280位密碼子的末位堿基出現(xiàn)缺失突變(840delT)，其母親為該突變位點的攜帶者，但在家系其他成員中未發(fā)現(xiàn)該突變位點的攜帶者。在正常人群中未檢測到上述兩種突變。 結(jié)論WISP3基因復合雜合性突變引起常染色體隱性遺傳性SEDT-PA。