二膦酸鹽對人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞生長及OPG-RANKL表達(dá)影響的實驗研究.pdf

1、目的：體外實驗觀察二膦酸鹽對骨肉瘤MG-63細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡，探討在一定時間范圍內(nèi)，二膦酸鹽誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的最適作用濃度。分析二膦酸鹽對細(xì)胞內(nèi)骨保護素OPG、RANKL在基因和蛋白水平表達(dá)上的影響，初步探討二膦酸鹽對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞作用可能機制?！　》椒ǎ?.將濃度分別為0.3、1、3、10、30、100、300、1000μmol/L二膦酸鹽藥物干預(yù)人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63作用24h、48h、72h，采用M

2、TT比色法測定其細(xì)胞活力，繪制細(xì)胞生長曲線，并計算藥物半數(shù)抑制濃度； 2.形態(tài)學(xué)觀察：熒光染色法，采用Hoechst33258細(xì)胞染色法觀察二膦酸鹽藥物干預(yù)后的骨肉瘤細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察早期、晚期凋亡細(xì)胞的形態(tài)。透射電鏡下觀察作用后早、晚期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)形態(tài)； 3.采用碘化丙啶(PI)染色藥物作用后的骨肉瘤細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡比例及細(xì)胞周期，F(xiàn)CM進行細(xì)胞周期分析及凋亡率檢測；

3、4.采用RT-PCR和Western blotting方法檢測OPG、RANKL在mRNA水平和蛋白水平的變化。 結(jié)果：1.二膦酸鹽藥物作用于人骨肉瘤細(xì)胞株24h、48h、72h后，細(xì)胞生長明顯受抑制，生長抑制曲線表現(xiàn)為上升趨勢，與對照組比較統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。腫瘤細(xì)胞生長抑制率呈現(xiàn)藥物濃度和時間依賴性。MTT比色法測得藥物作用72h對MG-63細(xì)胞的ID50為52.37±1.0μmol/L，實驗組與對照組確t驗分析t=2.

4、201，P<0.01； 2.二膦酸鹽濃度為50μmol/L作用于骨肉瘤細(xì)胞株72h后，經(jīng)Hoechst33258細(xì)胞染色熒光顯微鏡下可見早期凋亡細(xì)胞，隨著作用濃度和時間增加，早期凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，并出現(xiàn)晚期凋亡細(xì)胞，透射電鏡證實其對細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)改變； 3.細(xì)胞周期分析二膦酸鹽對G1期細(xì)胞阻滯，實驗組G2/M期細(xì)胞比例(7.13±0.91)％，相比對照組(32.15±2.31)％，P<0.01有統(tǒng)計學(xué)意義；二膦酸鹽50

5、μmol/L作用24、48、72h的MG-63細(xì)胞，經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色72h后細(xì)胞凋亡率(40.2±2.1)％相比對照組細(xì)胞(2.84±0.7)％有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01； 4.RT-PCR產(chǎn)物擴增出條帶位置，與預(yù)期條帶一致。在486bp大小片段處RANKL表達(dá)的實驗組與對照組無明顯差異；相反OPG的表達(dá)與對照組相比明顯增加，經(jīng)光密度分析，OPG表達(dá)增加是對照組1.8倍；Western印跡檢測結(jié)果

6、示，當(dāng)二膦酸鹽濃度為0.1～10μmol/L時印跡有明顯條帶，蛋白表達(dá)逐步上調(diào)，經(jīng)光密度分析，實驗組隨著藥物濃度增加OPG蛋白表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：1.二膦酸鹽對體外培養(yǎng)骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖數(shù)量與藥物濃度及時間有顯著依賴性； 2.體外實驗研究表明二膦酸鹽可明顯誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63凋亡，抑制細(xì)胞生長，細(xì)胞阻滯在G1期； 3.體外實驗探索了二膦酸鹽對骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)OPG、RANKL表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)其在mRNA水平和蛋