降鈣素基因相關(guān)肽通過NLRP3途徑抑制小鼠巨噬細(xì)胞系炎性激活實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene-related peptide，CGRP)是一種具有許多不同功能由神經(jīng)分泌的多肽，許多實(shí)驗(yàn)研究表明，異常巨噬細(xì)胞活化和產(chǎn)生自身核酸的自身抗體是特征系統(tǒng)性紅斑狼瘡。有人建議雌激素可以自身反應(yīng)性B細(xì)胞的增殖和刺激驅(qū)動(dòng)M2巨噬細(xì)胞[1，2]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)在干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)，一個(gè)主要的非—SLE的HLA風(fēng)險(xiǎn)等位基因，已被證明有男性高頻率[3]。IRF5最

2、近為提高M(jìn)1巨噬細(xì)胞分化[因此，它是可能的巨噬細(xì)胞差異男性和女性SLE患者的調(diào)節(jié)。炎癥的多蛋白復(fù)合物含有核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)類似物在黑色素瘤細(xì)胞或缺乏2（目標(biāo)），從而激活Caspase-1在刺激和促進(jìn)IL-1β生產(chǎn)NOD樣受體失調(diào)(NLR)PYRIN含蛋白3（NLRP3炎性體具有域）
　　神經(jīng)肽P物質(zhì)降鈣素基因相關(guān)肽分別包含11和37種氨基酸。它們經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)于感覺神經(jīng)元，它們分泌量的增加通常來源于共同的刺激物。有各種研究

3、表明神經(jīng)肽可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子的生產(chǎn)。降鈣素基因相關(guān)肽可改善因缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞炎癥和改善一氧化氮介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。將H9c2心肌細(xì)胞暴露于缺氧的環(huán)境中2小時(shí)，以建立缺氧缺血的環(huán)境，炎性小體是一種高分子量的蛋白復(fù)合體。它形成于當(dāng)細(xì)胞受到危險(xiǎn)或被相關(guān)病原體侵襲時(shí)的胞漿中。
　　研究中，我們使用不同濃度CGRP刺激靜息狀態(tài)下和LPS活化狀態(tài)下的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，探討CGRP對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β，TNF-α

4、分泌的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　1.在體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7，讓其生長于DMEM培養(yǎng)基（含10％FBS，1×105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素）中，37℃，5％CO2條件下中培養(yǎng)，3-4d傳代一次，傳代比例為1∶3。
　　2.在小鼠巨噬細(xì)胞中加入含有不同濃度CGRP和/或LPS的DMEM培養(yǎng)液(LPS50ng/mL,CGRP10ng/mL,CGPR30ng/mL,CGRP100ng/mL,CGRP3

5、0ng/mL+LPS50ng/mL)預(yù)處理。
　　3.使用qRT-PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)CGRP和/或LPS處理后的小鼠巨噬細(xì)胞IL-1β，TNF-α和NLRP3mRNA表達(dá)水平
　　4.采用小IL-1β腫瘤壞死因子，定量分析酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒對(duì)CGRP和/或LPS處理后的小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
　　5.蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同濃度CGRP和/或LPS處理小鼠RAW264.7細(xì)胞后，NLRP3，Caspase-1和Proc

6、aspase-1的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：經(jīng)鏡下觀察巨噬細(xì)胞成圓形或/和橢圓形，貼壁生長，狀態(tài)良好。
　　2.在體外小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中CGRP和/或LPS2，小鼠巨噬細(xì)胞在含不同濃度(LPS50ng/mL,CGRP10ng/mL,CGPR30ng/mL,CGRP100ng/mL,CGRP30ng/mL+LPS50ng/mL)培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)，3天后順利提取RNA、蛋白，預(yù)備下步實(shí)驗(yàn)。
　

7、　3.qRT-PCR檢測(cè)小鼠IL-1β、TNF-α、NLRP3mRNA,果提示CGRP處理LPS活化和未活化巨噬細(xì)胞后，IL-1β、TNF-αmRNA分泌水平較空白對(duì)照組相比，均明顯降低(P＜0.05)，且成濃度依賴性。
　　4.小鼠的IL-1β、TNF-αELISA試劑盒結(jié)果提示：CGRP(10ng/mL、30ng/mL，100ng/mL)處理后，IL-1β、TNF-αmRNA分泌水平與空白對(duì)照組相比，明顯降低(P＜0.05)，

8、且成濃度依賴性。
　　5.蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同濃度CGRP和/或LPS處理小鼠RAW264.7細(xì)胞后，NLRP3，Caspase-1蛋白表達(dá)水平和mRNA一致，Procaspase-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.本研究表明，CGRP抑制巨噬細(xì)胞炎性激活，其機(jī)制可能與CGRP抑制NLRP3表達(dá)與活性有關(guān);
　　2.LPS可刺激巨噬細(xì)胞，炎性因子分泌增加;
　　3.CGRP能抑制巨噬細(xì)胞