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文檔簡介
1、肺動脈高壓(PAH)是心血管外科領(lǐng)域內(nèi)常見的并發(fā)癥,尤其見于先天性心臟病。其基本病理改變?yōu)橐匝鼙谥心て交≡錾鸀樘攸c的血管重構(gòu)。以往研究表明肺血管壁平滑肌增殖增生是受內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的嚴(yán)密調(diào)控的。而由于肺高灌注所引起的肺動脈高壓的病理改變中,肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞往往受損、壞死及功能異常,導(dǎo)致局部細(xì)胞因子分泌紊亂,誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞增殖增生,肺血管重構(gòu)。近年來,在外周血中發(fā)現(xiàn)具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞,此類細(xì)胞可以遷移
2、到受損組織局部并分化為有正常分泌功能的內(nèi)皮細(xì)胞。因此內(nèi)皮祖細(xì)胞可以既作為內(nèi)皮組織修復(fù)工具,又可同時作為有效的目的基因載體。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)具 有強(qiáng)大的肺血管舒張及抑制平滑肌增殖的作用,在肺動脈高壓的病理過程中其水平,以往研究證實CGRP通過與血管壁平滑肌細(xì)胞表面的CGRP受體結(jié)合,明顯緩解肺動脈高壓。本研究將外源性CGRP基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,并將攜帶外源CGRP基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞通過頸靜脈注射給左向右分流引起的肺動脈高壓的大鼠
3、模型,觀察其緩解肺動脈高壓及抑制肺血管重構(gòu)的治療作用,以期為肺動脈高壓的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 方法: 本研究采用外周血單個核細(xì)胞密度梯度離心的方法采集外周血單個核細(xì)胞,經(jīng)過細(xì)胞因子的定向誘導(dǎo)分化,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)至一周,利用 DiI-acLDL,F(xiàn)ITC-Ulcx-lectin雙熒光顯色法及CD34, CD133細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)對內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。根據(jù)CGRP全長cDNA序列設(shè)計
4、一對CGRP開放閱讀框上下游引物,并分別引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點,以pGEM-T-CGRP為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng),將PCR產(chǎn)物與真核表達(dá)載體pEGFP-N1進(jìn)行EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切,酶切產(chǎn)物片段經(jīng)過純化后,進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α,轉(zhuǎn)化子經(jīng)過質(zhì)粒擴(kuò)增提取后,經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光,并通過放射免疫方法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中CGRP濃度,證實內(nèi)皮祖細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染外
5、源質(zhì)粒基因并且可分泌CGRP。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分成2×10<'6> cells/mL 小單位準(zhǔn)備進(jìn)行靜脈注射。將6-8周齡的無胸腺裸大鼠隨機(jī)分成4組,分別為對照組、左向右分流組、分流+EPC移植組及分流+CGRP-EPC移植組。通過腹主動脈與相鄰下腔靜脈之間建立左向右分流通道,飼養(yǎng)10周,以完成動力性肺動脈高壓動物模型的建立。以1×10<'6> EPCs,1×10<'6>CGRP-EPCs(均為500uL)分別經(jīng)過頸靜脈注射給分流+EPC移植
6、組及分流+CGRP-EPC移植組,繼續(xù)飼養(yǎng)4周。以右心導(dǎo)管法測量各組大鼠肺動脈壓力,通過熱稀釋方法測量肺血管阻力(PVR),取大鼠肺葉組織,利用放射免疫方法測定肺組織內(nèi)以及血漿中的CGRP含量,同時提取肺組織內(nèi)的RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定CGRP mRNA含量。針對大鼠CD31抗原,采用小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測EPC在肺組織內(nèi)的分布。肺葉組織進(jìn)行切片,HE染色,并利用計算機(jī)圖象分析技術(shù)檢測
7、肺小動脈結(jié)構(gòu)變化并進(jìn)行組間比較,切取肺組織小塊(1mm×1mm×1mm),系列脫水固定后,進(jìn)行透射電鏡觀察各組肺小動脈壁超微結(jié)構(gòu)變化。另外取24只大鼠隨機(jī)分為3組,進(jìn)行分流手術(shù)后分別接受EPC移植,CGRP-EPC移植,其余一組不接受細(xì)胞移植,采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析。 結(jié)果: 1.從人外周血中分離的單個核細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子誘導(dǎo)后,3天后可見細(xì)胞伸展,并見梭形細(xì)胞:5天形成細(xì)胞集落,約一周左右形成典型的
8、鋪路石樣結(jié)構(gòu),出現(xiàn)多個細(xì)胞團(tuán),中間為圓形細(xì)胞,貼壁的梭型細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)的周圍向外生長,第10天左右可見首尾相連形成條索狀結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡下可觀察到同時發(fā)綠色(DiI-acLDL)和紅色(HTC-Ulcx-lcctin)熒光的雙陽性貼壁細(xì)胞。FACS檢測,CD34 陽性率為 77.2%±10.9%,和AC133陽性率為27.1%±9.1%。 2.重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CGRP經(jīng)酶切鑒定正確。體外經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染陽性率
9、為46%。轉(zhuǎn)染CGRP基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞24小時后對其培養(yǎng)液經(jīng)放免測定發(fā)現(xiàn)有CGRP分泌,并且于第5天其分泌值達(dá)到高峰,分泌持續(xù)達(dá)3周以上。分流手術(shù)的大鼠接受CGRP-EPC后其肺組織內(nèi)CGRP的含量較單純分流手術(shù)組的大鼠顯著增加(P<0.05),在所有接受分流手術(shù)大鼠的血漿中CGRP含量均較對照組降低,而接受分流手術(shù)的3組大鼠之間并無顯著差異(P>0.05)。 3.細(xì)胞移植4周后經(jīng)過RT-PCR檢測各組大鼠肺組織內(nèi)的CGRP m
10、RNA 均有表達(dá),而接受CGRP-EPC移植的實驗組大鼠其肺組織內(nèi)的CGRPmRNA 含量明顯高于其余3組大鼠(P<0.05)。 4.免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞移植4周后,接受CGRP-EPC移植的實驗組大鼠的肺組織血管床散在有綠色熒光分布,在其余3組大鼠的肺組織內(nèi)未見綠色熒光分布;在CGRP-EPC組大鼠的心臟,肝臟以及腎臟等主要器官內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)有明顯的綠色熒光分布。 5.肺組織切片染色病理檢查發(fā)現(xiàn)接受EPC或是CGRP-E
11、PC移植組大鼠的肺小動脈管壁面積百分比同單純分流組相比較均顯著降低(P<0.05),而管腔面積百分比卻顯著增加(P<0.05);經(jīng)過計算機(jī)定量分析分流組大鼠的肺小動脈管壁厚度較對照組明顯增加,而接受EPC或是CGRP-EPC移植組大鼠的肺小動脈管壁增厚程度較單純分流組顯著減輕(P<0.05);CGRP-EPC組較EPC組比較其減輕程度更加明顯(P<0.05)。 6.肺小動脈超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)在單純分流組大鼠其肺小動脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞
12、腫脹增大,并見內(nèi)皮細(xì)胞壞死從管壁脫落現(xiàn)象,內(nèi)彈力膜崩解,細(xì)胞外基質(zhì)以及膠原纖維堆積;在EPC移植組發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞變性與再生同時并存,內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜連接較為疏松;而在CGRP-EPC移植組中見到再生的內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜連接較為緊密,細(xì)胞形態(tài)接近正常,細(xì)胞的變性壞死現(xiàn)象減少。 7.血流動力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)單純接受分流手術(shù)組大鼠的平均肺動脈壓力(mPAP)及肺血管阻力(PVR)均較對照組明顯增加(P<0.05);接受EPC或是CGRP-EPC
13、移植組大鼠的肺血管阻力與單純分流組相比均有所降低(P<0.05),而CGRP-EPC移植組的肺血管阻力明顯低于EPC組(P<0.05);肺動脈壓力在單純分流組與EPC移植組之間無顯著差別(P>0.05),而CGRP-EPC移植組的肺動脈壓力卻較單純分流組和EPC移植組有明顯降低(P<0.05)。體循環(huán)血流動力學(xué)參數(shù)(血壓、心率、心輸出量、體循環(huán)血管阻力)在4組之間無明顯差異(P均>0.05)。 8.對Kaplan-Meier生存
14、分析顯示CGRP-EPC移植組大鼠的生存率顯著高于分流組(P<0.05),而EPC移植組的生存率與分流組相比并未見顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論: 1.從人類外周血分離出的單個核細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)可以得到具有生物活性和分化潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞用于細(xì)胞移植。 2.可以人工構(gòu)建包含外源CGRP基因的真核質(zhì)粒表達(dá)載體,通過體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,產(chǎn)生并分泌具有生物學(xué)活性的CGRP。 3.內(nèi)皮祖細(xì)胞在體內(nèi)可以
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