以細(xì)胞增殖抑制基因p27為靶點治療低氧性肺動脈高壓的實驗研究.pdf

1、在低氧性肺動脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension,HPH)發(fā)生發(fā)展過程中，低氧性肺血管收縮(hypoxicpulmonaryvasoconstriction,HPV)和肺血管重建是其兩個主要病理生理學(xué)特征。肺血管重建是肺動脈高壓持續(xù)存在且難以治療的關(guān)鍵原因，肺動脈中膜平滑肌細(xì)胞的異常增生為肺血管壁重建的一個主要病理表現(xiàn)。隨著對HPH發(fā)生機(jī)理的研究深入，抑制或逆轉(zhuǎn)肺血管重建已成為防治HPH及其并發(fā)癥的主要目標(biāo)，

2、但目前尚缺乏特異性治療措施。我們實驗室之前的研究顯示丹參酮IIA磺酸鈉(sodiumtanshinoneIIAsulphonate,STS)可抑制低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonaryarterialsmoothmusclecell,PASMC)增殖，防止肺小動脈重塑，但其機(jī)制仍未闡明。
　　細(xì)胞增殖與細(xì)胞增殖周期有關(guān)，細(xì)胞增殖周期受細(xì)胞周期蛋白(cyclin)及其依賴蛋白激酶(cyclin-dependentkinase

3、,CDK)和CDK抑制物(cyclin-dependentkinaseinhibitor,CDKI)的共同調(diào)控。p27是抑制細(xì)胞增殖的重要因子之一。目前已有研究結(jié)果顯示HPH時p27是肺動脈平滑肌細(xì)胞中唯一表達(dá)量顯著減少的CDKI，上調(diào)p27可抑制PASMC增殖。因此，增加p27的表達(dá)將有利于抑制肺血管結(jié)構(gòu)重建,防治肺動脈壓過度增高，改善HPH病人的預(yù)后。S期蛋白相關(guān)激酶2(Sphasekinaseassociatedprotein2,

4、Skp2)是p27的降解過程的一個重要調(diào)控分子，可被磷酸化的Akt(p-Akt)激活進(jìn)而參與p27的降解調(diào)節(jié)。
　　本實驗通過觀察STS在整體和細(xì)胞水平抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用及其對p27影響，探討STS治療HPH的可能機(jī)制。并進(jìn)一步采用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了HS-p27-pAcGFP1-1重組質(zhì)粒，通過sm22啟動子和低氧反應(yīng)元件(hypoxiaresponseelement,HRE)增強(qiáng)子的共同作用使外源性p27靶向定位于

5、處于低氧條件下的血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，從而條件性調(diào)控p27的表達(dá)，實現(xiàn)特異性、靶向性、有效抑制低氧性PASMC增殖作用，達(dá)到防治HPH的目的，有望為HPH的防治提供新的策略和手段。
　　一、STS上調(diào)p27的表達(dá)防治大鼠HPH的發(fā)生
　　1、實驗?zāi)康?br>　　從整體和細(xì)胞兩個水平觀察STS抑制低氧誘導(dǎo)的肺小動脈重塑及PASMC增殖的作用及其對p27、Skp2及p-Akt的影響，探討STS預(yù)防HPH發(fā)生和抑制低氧性PASMC增殖

6、作用的可能機(jī)制。
　　2、實驗方法
　　將大鼠或原代培養(yǎng)的大鼠PASMC分為四個組：常氧組(N)，常氧給藥組(N+STS)，低氧組(H)，低氧給藥組(H+STS)。利用低壓低氧艙復(fù)制大鼠的HPH模型；導(dǎo)管法檢測血流動力學(xué)指標(biāo)；計算右心肥厚指數(shù)；肺組織切片HE染色檢測肺小動脈的形態(tài)學(xué)變化；MTT法檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化；RT-PCR檢測肺組織和培養(yǎng)細(xì)胞中p27、Skp2的表達(dá)；Western-blot檢測

7、p27、Skp2和p-Akt的表達(dá)。
　　3、實驗結(jié)果
　　（1）動物實驗結(jié)果：低氧性肺動脈高壓模型復(fù)制成功，STS可以明顯減輕低氧引起的肺動脈高壓和肺小動脈壁重塑。低氧使大鼠肺組織內(nèi)p27的蛋白表達(dá)水平降低，但不影響p27mRNA的表達(dá)，低氧可激活A(yù)kt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使p-Akt表達(dá)明顯增加，誘導(dǎo)Skp2在mRNA和蛋白表達(dá)水平升高；STS可以降低低氧引起的p-Akt表達(dá)的增多，抑制低氧誘導(dǎo)的Skp2mRNA和蛋白表達(dá)的升

8、高，逆轉(zhuǎn)低氧對p27蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。
　?。?）細(xì)胞實驗結(jié)果：低氧刺激PASMC增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞由G0/G1期向G2/S期的轉(zhuǎn)化，激活A(yù)kt信號通路，p-Akt表達(dá)增加，誘導(dǎo)Skp2mRNA和蛋白表達(dá)增加，p27蛋白表達(dá)降低；STS可以抑制低氧引起的PASMC的增殖，減少低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，抑制低氧引起的Skp2和p-Akt升高及p27蛋白表達(dá)的減少。
　　4、實驗結(jié)論
　　低氧通過Akt-Skp2-p27通路促

9、進(jìn)PASMC增殖，STS則可以阻斷該通路抑制低氧引起的PASMC增殖。
　　二、HRE增強(qiáng)的sm22啟動子驅(qū)動p27靶向性抑制低氧引起的PASMC增殖的研究
　　1、實驗?zāi)康?br>　　構(gòu)建HS-p27-pAcGFP1-1重組質(zhì)粒，條件性調(diào)控p27的表達(dá)，特異性、靶向性有效性的抑制低氧性PASMC增殖。
　　2、實驗方法
　　應(yīng)用PCR、酶切、連接等技術(shù)構(gòu)建p27-pcDNA3.1、sm22-pAcGFP1-1、

10、HRE-sm22-pAcGFP1-1、sm22-p27-pAcGFP1-1、HS-p27-pAcGFP1-1五種重組質(zhì)粒。
　　在不同種類的細(xì)胞轉(zhuǎn)染sm22-pAcGFP1-1檢測sm22啟動子特異性；在PASMC轉(zhuǎn)染HRE-sm22-pAcGFP1-1后給予常氧和低氧刺激檢測HRE對低氧的反應(yīng)性；MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化，Western-blot檢測p27、Skp2的表達(dá)。
　　3、實驗結(jié)果

11、　?。?）成功構(gòu)建了五種重組質(zhì)粒。
　　（2）轉(zhuǎn)染p27-pcDNA3.1后PASMC細(xì)胞增殖被顯著抑制。
　?。?）轉(zhuǎn)染sm22-pAcGFP1-1質(zhì)粒后48h，綠色熒光蛋白GFP在血管平滑肌細(xì)胞A10、PASMC中有表達(dá)，而在293、3T3、A549等非平滑肌細(xì)胞內(nèi)未見表達(dá)。
　　（4）轉(zhuǎn)染HRE-sm22-pAcGFP1-1質(zhì)粒后48h低氧組PASMC中的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于常氧組。
　　（5）PASMC在轉(zhuǎn)染