Dicer酶對巨噬細胞功能極化的影響.pdf

1、研究目的：觀察巨噬細胞在M1，M2不同功能極化狀態(tài)下Dicer酶的表達情況；構建針對Dicer酶的干擾載體，建立Dicer酶表達抑制的巨噬細胞株；檢測Dicer酶表達抑制巨噬細胞功能和M1、M2功能極化的改變，明確小分子RNA合成通路障礙對巨噬細胞功能極化的影響。
　　 研究方法：(1)通過Real time PCR和Western blot檢測原代骨髓來源巨噬細胞、腹腔巨噬細胞以及巨噬細胞系RAW264.7在M1、M2不同功能

2、狀態(tài)下Dicer酶的表達情況。(2)將Dicer基因mRNA作為RNA干擾的靶區(qū)，設計特異的Dicer-siRNA干擾序列，插入含U6和H1雙啟動子的慢病毒載體Double-promoter pFIV-H1/U6 siRNAExpression vector中，構建成抑制Dicer基因表達的RNA干擾表達載體，并轉染小鼠巨噬細胞株RAW264.7中，通過Real time PCR和Western blot觀察干擾載體對Dicer酶表達的

3、抑制效果；通過microRNA real time PCR檢測對mir-155、mir-223的抑制效果；通過CCK8檢測對細胞增殖的影響；通過凋亡試劑盒檢測對細胞死亡凋亡的影響；通過Transwell小室檢測細胞遷移功能；通過FITC-dextran吞噬實驗檢測巨噬細胞的吞噬功能。(3)通過Real time PCR和體外細胞殺菌實驗檢測抑制Dicer酶表達后巨噬細胞M1\M2功能狀態(tài)的變化。
　　 研究結果：(1)Dicer

4、酶在巨噬細胞M1功能狀態(tài)下表達降低，耐受時表達升高；在巨噬細胞M2功能狀態(tài)下表達增高。(2)成功構建Dicer-siRNA慢病毒表達載體及篩選出有效干擾Dicer酶表達的穩(wěn)定巨噬細胞株；CCK8及凋亡實驗顯示，當Dicer酶受抑制后，細胞增殖未受影響，凋亡/死亡率有所增高；遷移實驗證實Dicer酶表達受抑后細胞遷移能力沒有明顯改變；吞噬實驗證明Dicer酶抑制未影響細胞的吞噬活力。(3)Dicer酶表達下調抑制了巨噬細胞向M2功能方向極