鐵對(duì)巨噬細(xì)胞M1極化和小鼠抗細(xì)菌感染能力的影響.pdf

1、鐵不僅在動(dòng)物機(jī)體的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能，而且是病原微生物增殖生長的必需營養(yǎng)素，兩者在感染情況下對(duì)鐵的利用存在相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系。機(jī)體本身存在著精密嚴(yán)格地調(diào)控體系來維持鐵代謝的穩(wěn)態(tài)。巨噬細(xì)胞作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與到鐵代謝中的免疫細(xì)胞，在機(jī)體鐵與病原體鐵的競(jìng)爭(zhēng)中起著重要作用。但目前對(duì)于細(xì)菌感染如何影響巨噬細(xì)胞的鐵調(diào)控，進(jìn)而影響其免疫功能的發(fā)揮及機(jī)制尙不清楚。
　　本研究在探究細(xì)菌感染對(duì)巨噬細(xì)胞鐵代謝影響的基礎(chǔ)上，從巨噬細(xì)胞極化角度

2、進(jìn)一步探索鐵影響其調(diào)控的可能機(jī)制，為在感染條件下仔豬缺鐵癥的預(yù)防和控制提供新思路。主要研究內(nèi)容如下:
　　試驗(yàn)一:細(xì)菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)其鐵代謝的影響
　　為了探究巨噬細(xì)胞對(duì)于胞內(nèi)菌或胞外菌的侵染是否存在不同的調(diào)鐵機(jī)制，本試驗(yàn)利用鼠傷寒沙門氏菌（S.Typhimurium CMCC50013，胞內(nèi)菌）和大腸桿菌K88(E.coli K88，胞外菌)侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/2)，檢測(cè)其鐵代謝情況。結(jié)果顯示:豬肺泡巨噬細(xì)胞

3、對(duì)于胞內(nèi)菌與胞外菌的侵染具有完全不同的鐵調(diào)控機(jī)制。胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，①在鐵代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因方面:降低了鐵調(diào)素Hepcidin的相對(duì)表達(dá)量，而提高了鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP1和IRP2的相對(duì)表達(dá)量;②在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因方面:降低了天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白Nramp的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05)，提高了膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FPN的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.01);③在鐵存儲(chǔ)相關(guān)基因方面:降低了鐵蛋白FtH的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.01);④提高了

4、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白Lcn2和乳鐵蛋白LF的相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05）。而胞外菌大腸桿菌K88侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞后，除Lcn2和LF的相對(duì)表達(dá)量升高外(P＜0.05)，其他結(jié)果與胞內(nèi)菌侵染的結(jié)果完全相反。上述研究結(jié)果表明:豬肺泡巨噬細(xì)胞在胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌侵染時(shí)，減少對(duì)胞外鐵的攝取，促進(jìn)胞內(nèi)鐵往胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，降低胞內(nèi)供細(xì)菌增殖利用的自由鐵離子;而在胞外菌大腸桿菌K88侵染時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)胞外鐵的攝取，減少胞內(nèi)鐵往胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胞內(nèi)對(duì)自由鐵離子的存儲(chǔ)

5、，減少胞外可供細(xì)菌增殖利用的自由鐵離子，因而機(jī)體在感染的情況下，可能呈現(xiàn)缺鐵狀態(tài)。
　　試驗(yàn)二:鐵對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞M1型極化的影響
　　機(jī)體在感染的情況下，會(huì)產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞，并向M1型極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。結(jié)合試驗(yàn)一的結(jié)果，細(xì)菌感染會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞鐵代謝發(fā)生變化，那么鐵對(duì)巨噬細(xì)胞向M1型極化造成怎樣的影響呢？本實(shí)驗(yàn)利用干擾素IFN-γ誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞向M1型極化，同時(shí)添加鐵檸檬酸鐵銨(FAC)，探究鐵對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞向M1

6、型極化的影響。結(jié)果顯示:用20ng/mL的IFN-γ誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞24小時(shí)，能夠顯著地提高M(jìn)1型巨噬細(xì)胞標(biāo)識(shí)因子COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P＜0.01)，說明利用IFN-γ體外誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞向M1型極化可行。豬肺泡巨噬細(xì)胞極化之后，鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP1和IRP2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著增加(P＜0.05)，二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

7、FPN的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），鐵蛋白FtH的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)，增加細(xì)胞對(duì)鐵攝取，減少胞內(nèi)鐵的輸出，使細(xì)胞鐵含量增加，細(xì)胞外鐵含量相對(duì)于降低。通過CCK-8和LDH試驗(yàn)確定利用25μM的FAC聯(lián)合20ng/mL的IFN-γ誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞向M1型極化，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)識(shí)因子COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于IFN-γ單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01

8、)，且對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化通路蛋白STAT-1的磷酸化水平也比IFN-γ單獨(dú)誘導(dǎo)時(shí)的磷酸化水平顯著降低（P＜0.01）。檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能顯示，鐵聯(lián)合干擾素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，其吞噬功能與干擾素誘導(dǎo)極化組相比，差異不顯著。另外在小鼠RAW264.7細(xì)胞系中做了同樣的試驗(yàn)處理，結(jié)果與豬肺泡巨噬細(xì)胞的試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致，且Western Blot試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)iNOS的表達(dá)量，其結(jié)果均顯示加鐵聯(lián)合誘導(dǎo)后會(huì)導(dǎo)致iNOS的表達(dá)量顯著降低(

9、P＜0.05)，試驗(yàn)結(jié)果表明:鐵能夠抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，但對(duì)其吞噬功能不影響。
　　試驗(yàn)三:外源鐵補(bǔ)充對(duì)小鼠感染模型抗感染能力的影響
　　根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果可知，感染時(shí)，巨噬細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而鐵卻能抑制其向M1型極化，那么感染的情況下，補(bǔ)充外源鐵是否會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響？本試驗(yàn)通過用大腸桿菌O157∶H7灌胃3周齡斷奶小鼠，構(gòu)建小鼠感染模型，再對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射補(bǔ)充外源鐵，探究機(jī)體在感染狀況下外源鐵補(bǔ)充

10、對(duì)其抗感染能力的影響。結(jié)果顯示:小鼠感染情況下，對(duì)其補(bǔ)充外源鐵，①小鼠呈現(xiàn)嚴(yán)重的反應(yīng)遲鈍，食欲降低，體重迅速下降現(xiàn)象，且個(gè)別死亡;②肝臟中細(xì)菌數(shù)量明顯增多(P＜0.01);③肝臟、脾臟和回腸中炎性因子IL-1β和TNF-α的相對(duì)表達(dá)量均顯著提高（P＜0.01）。結(jié)果表明:機(jī)體在感染的情況下，進(jìn)行外源鐵的補(bǔ)充，會(huì)加重機(jī)體感染癥狀。
　　綜上所述，在病原菌感染的情況下，機(jī)體一方面通過免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量巨噬細(xì)胞，并向M1型巨噬細(xì)胞極化，從