鐵對巨噬細胞M1極化和小鼠抗細菌感染能力的影響.pdf

1、鐵不僅在動物機體的生命活動中發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能，而且是病原微生物增殖生長的必需營養(yǎng)素，兩者在感染情況下對鐵的利用存在相互競爭的關(guān)系。機體本身存在著精密嚴格地調(diào)控體系來維持鐵代謝的穩(wěn)態(tài)。巨噬細胞作為首個被發(fā)現(xiàn)參與到鐵代謝中的免疫細胞，在機體鐵與病原體鐵的競爭中起著重要作用。但目前對于細菌感染如何影響巨噬細胞的鐵調(diào)控，進而影響其免疫功能的發(fā)揮及機制尙不清楚。
　　本研究在探究細菌感染對巨噬細胞鐵代謝影響的基礎(chǔ)上，從巨噬細胞極化角度

2、進一步探索鐵影響其調(diào)控的可能機制，為在感染條件下仔豬缺鐵癥的預(yù)防和控制提供新思路。主要研究內(nèi)容如下:
　　試驗一:細菌感染豬肺泡巨噬細胞對其鐵代謝的影響
　　為了探究巨噬細胞對于胞內(nèi)菌或胞外菌的侵染是否存在不同的調(diào)鐵機制，本試驗利用鼠傷寒沙門氏菌（S.Typhimurium CMCC50013，胞內(nèi)菌）和大腸桿菌K88(E.coli K88，胞外菌)侵染豬肺泡巨噬細胞(3D4/2)，檢測其鐵代謝情況。結(jié)果顯示:豬肺泡巨噬細胞

3、對于胞內(nèi)菌與胞外菌的侵染具有完全不同的鐵調(diào)控機制。胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌侵染豬肺泡巨噬細胞后，①在鐵代謝調(diào)節(jié)相關(guān)基因方面:降低了鐵調(diào)素Hepcidin的相對表達量，而提高了鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP1和IRP2的相對表達量;②在鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)基因方面:降低了天然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白Nramp的相對表達量(P＜0.05)，提高了膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白FPN的相對表達量(P＜0.01);③在鐵存儲相關(guān)基因方面:降低了鐵蛋白FtH的相對表達量(P＜0.01);④提高了

4、脂質(zhì)運載蛋白Lcn2和乳鐵蛋白LF的相對表達量(P＜0.05）。而胞外菌大腸桿菌K88侵染豬肺泡巨噬細胞后，除Lcn2和LF的相對表達量升高外(P＜0.05)，其他結(jié)果與胞內(nèi)菌侵染的結(jié)果完全相反。上述研究結(jié)果表明:豬肺泡巨噬細胞在胞內(nèi)菌鼠傷寒沙門氏菌侵染時，減少對胞外鐵的攝取，促進胞內(nèi)鐵往胞外轉(zhuǎn)運，降低胞內(nèi)供細菌增殖利用的自由鐵離子;而在胞外菌大腸桿菌K88侵染時，促進細胞對胞外鐵的攝取，減少胞內(nèi)鐵往胞外轉(zhuǎn)運，增加胞內(nèi)對自由鐵離子的存儲

5、，減少胞外可供細菌增殖利用的自由鐵離子，因而機體在感染的情況下，可能呈現(xiàn)缺鐵狀態(tài)。
　　試驗二:鐵對豬肺泡巨噬細胞M1型極化的影響
　　機體在感染的情況下，會產(chǎn)生大量的巨噬細胞，并向M1型極化，促進炎癥反應(yīng)。結(jié)合試驗一的結(jié)果，細菌感染會導(dǎo)致巨噬細胞鐵代謝發(fā)生變化，那么鐵對巨噬細胞向M1型極化造成怎樣的影響呢？本實驗利用干擾素IFN-γ誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細胞向M1型極化，同時添加鐵檸檬酸鐵銨(FAC)，探究鐵對豬肺泡巨噬細胞向M1

6、型極化的影響。結(jié)果顯示:用20ng/mL的IFN-γ誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細胞24小時，能夠顯著地提高M1型巨噬細胞標識因子COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相對表達量(P＜0.01)，說明利用IFN-γ體外誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細胞向M1型極化可行。豬肺泡巨噬細胞極化之后，鐵調(diào)節(jié)蛋白IRP1和IRP2的mRNA相對表達量均顯著增加(P＜0.05)，二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白DMT1的mRNA相對表達量顯著增加(P＜0.01)，膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白

7、FPN的mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.01），鐵蛋白FtH的mRNA相對表達量顯著增加(P＜0.01)，增加細胞對鐵攝取，減少胞內(nèi)鐵的輸出，使細胞鐵含量增加，細胞外鐵含量相對于降低。通過CCK-8和LDH試驗確定利用25μM的FAC聯(lián)合20ng/mL的IFN-γ誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細胞向M1型極化，M1型巨噬細胞標識因子COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相對表達量相對于IFN-γ單獨誘導(dǎo)時的表達量顯著降低(P＜0.01

8、)，且對M1型巨噬細胞極化通路蛋白STAT-1的磷酸化水平也比IFN-γ單獨誘導(dǎo)時的磷酸化水平顯著降低（P＜0.01）。檢測巨噬細胞吞噬功能顯示，鐵聯(lián)合干擾素誘導(dǎo)巨噬細胞極化，其吞噬功能與干擾素誘導(dǎo)極化組相比，差異不顯著。另外在小鼠RAW264.7細胞系中做了同樣的試驗處理，結(jié)果與豬肺泡巨噬細胞的試驗結(jié)果趨勢一致，且Western Blot試驗和免疫熒光試驗檢測iNOS的表達量，其結(jié)果均顯示加鐵聯(lián)合誘導(dǎo)后會導(dǎo)致iNOS的表達量顯著降低(

9、P＜0.05)，試驗結(jié)果表明:鐵能夠抑制巨噬細胞向M1型極化，但對其吞噬功能不影響。
　　試驗三:外源鐵補充對小鼠感染模型抗感染能力的影響
　　根據(jù)前面的試驗結(jié)果可知，感染時，巨噬細胞向M1型極化，促進炎癥反應(yīng)，而鐵卻能抑制其向M1型極化，那么感染的情況下，補充外源鐵是否會對機體產(chǎn)生不良影響？本試驗通過用大腸桿菌O157∶H7灌胃3周齡斷奶小鼠，構(gòu)建小鼠感染模型，再對小鼠進行腹腔注射補充外源鐵，探究機體在感染狀況下外源鐵補充

10、對其抗感染能力的影響。結(jié)果顯示:小鼠感染情況下，對其補充外源鐵，①小鼠呈現(xiàn)嚴重的反應(yīng)遲鈍，食欲降低，體重迅速下降現(xiàn)象，且個別死亡;②肝臟中細菌數(shù)量明顯增多(P＜0.01);③肝臟、脾臟和回腸中炎性因子IL-1β和TNF-α的相對表達量均顯著提高（P＜0.01）。結(jié)果表明:機體在感染的情況下，進行外源鐵的補充，會加重機體感染癥狀。
　　綜上所述，在病原菌感染的情況下，機體一方面通過免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量巨噬細胞，并向M1型巨噬細胞極化，從