2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是最早于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)的一種新型病毒性傳染病,是現(xiàn)今世界上危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的疾病之一。巨噬細(xì)胞是一種分布廣泛的免疫細(xì)胞,可以根據(jù)內(nèi)環(huán)境的變化從而極化為不同的類型:經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1),以及替代活化巨噬細(xì)胞(M2)。豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophage,PAMs)是PR

2、RSV感染后豬只體內(nèi)最重要的靶細(xì)胞。所以本實(shí)驗(yàn)首先通過建立PAMs體外極化模型,研究PAMs極化對PRRSV感染的影響以及PRRSV感染對PAMs影響的動(dòng)態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)采用預(yù)冷法分離PAMs,并在體外進(jìn)行培養(yǎng),分別用LPS/IFN-γ誘導(dǎo)刺激M1型巨噬細(xì)胞;用IL-4誘導(dǎo)刺激分化為M2型巨噬細(xì)胞。通過半定量PCR分別檢測M1,M2型Marker(M1:IL-1β,IL-12,IL-23和CXCL10; M2:Arg-1,IL-10,PP

3、ARγ和YM-1)表達(dá)量的變化,從核酸水平上證明極化模型的成功。同時(shí)用Western blotting從蛋白水平上確定M1型,M2型PAMs的極化成功。之后用500TCID50 HuN4-F5株P(guān)RRSV感染極化后的PAMs亞型,在感染后的12,24,36和48h分別通過間IFA和Western blotting對PRRSV的感染量進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后的12至36h內(nèi)M1型PAMs中PRRSV的感染量明顯低于正常組和M2型PAMs

4、的感染量,而在感染后的48h時(shí)M1組中PRRSV的感染量與正常組和M2型PAMs中的感染量基本一致,無顯著性的差異。
  然而PAMs主要通過其表面的模式識別受體(pattern recognitionreceptor, PRR)發(fā)揮其天然免疫防御的功能。那么是否PRRSV感染M1型巨噬細(xì)胞對其模式識別受體產(chǎn)生了影響,從而M1型巨噬細(xì)胞對PRRSV感染在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生了抑制。因此我們通過熒光定量PCR的方法對感染PRRSV的M1型

5、巨噬細(xì)胞模式識別受體mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了測定,并同時(shí)對被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的KLF4基因也進(jìn)行了測定。而在測定結(jié)果中我們意外的發(fā)現(xiàn)PRRSV感染極化后M1型巨噬細(xì)胞中的KLF4表達(dá)量與M1型巨噬細(xì)胞對PRRSV復(fù)制的影響趨勢相似。結(jié)果表明感染PRRSV后,隨著時(shí)間的變化M1型巨噬細(xì)胞中KLF4的表達(dá)量逐漸降低,在12h達(dá)到最低,24h后KLF4的表達(dá)量逐漸升高,且在感染后48h時(shí)KLF4的表達(dá)量與正常組的表達(dá)量基本一致,

6、無顯著性差異。
  因此為了進(jìn)一步研究豬KLF4基因?qū)RRSV復(fù)制的影響,本實(shí)驗(yàn)通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到豬KLF4基因,通過TA克隆構(gòu)建pMD18-T-KLF4重組質(zhì)粒。酶切鑒定后將KLF4的cDNA亞克隆至pCMV-HA載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-HA-KLF4在Marc-145中,12h后感染PRRSV,并在感染后24h通過Western blotting對PRRSV的感染量進(jìn)行進(jìn)行測定。

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