豬GBP1、GBP2基因的克隆及其對PRRSV和PRV增殖的影響.pdf

1、干擾素誘導的GBPs又稱p65 GTPase，屬于干擾素誘導的GTPase超家族，是一種重要的干擾素刺激基因(ISGs)。GBPs最早發(fā)現(xiàn)于1979年，Gupta發(fā)現(xiàn)經(jīng)IFN-γ刺激后，人的成纖維細胞可以產(chǎn)生一種67kDa的蛋白。GBP蛋白與Mx蛋白同屬GTPase家族。自1979年被發(fā)現(xiàn)以后，后續(xù)的研究中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)干擾素誘導的GBPs家族在調控細胞增殖和抵抗病原體感染方面具有重要作用。目前對干擾素誘導的GBPs家族的研究主要集中在人和小

2、鼠上，大量實驗證實了干擾素誘導的GBPs家族具有抵抗病毒感染的作用，但具體機制尚不明晰。目前對豬源GBPs生物學功能的研究并不多，僅有豬源GBPs可以顯著抑制鼠傷寒沙門氏桿菌增殖的報道，豬源GBPs是否有抑制病毒增殖的作用目前尚無報道。PRRSV和PRV引發(fā)的疾病給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。本研究以豬源干擾素誘導的鳥苷酸結合蛋白家族中GBP1和GBP2兩個成員為研究對象，研究豬GBPs對PRRSV和PRV增殖的影響，以及PRRSV和P

3、RV感染對GBPs表達的影響，主要研究內容如下:
　　1.豬GBP1和GBP2基因的擴增和序列分析
　　從PK-15細胞中克隆了豬GBP1和GBP2基因的cDNA序列，其大小分別為1773bp和1776bp，這與GenBank上所報道的豬GBP1和GBP2序列基本一致，同源性分別為99.44％和99.5％。序列分析發(fā)現(xiàn):豬GBP1和GBP2核苷酸和氨基酸的同源性分別為77.31％和69.20％。系統(tǒng)進化樹分析表明:不同物種間

4、GBP1和GBP2的同源性很高，其中豬與人的GBP1和GBP2同源性最高，這說明干擾素誘導的GBPs家族在進化上比較保守。
　　2.豬GBP1和GBP2蛋白的結構預測
　　通過蛋白質結構分析發(fā)現(xiàn)豬GBP1和GBP2具有干擾素誘導的GBPs家族的典型結構即N端可以結合GTP的球狀結構域、C端α螺旋以及中問連接區(qū)域。
　　3.豬GBP1和GBP2蛋白的真核表達及亞細胞定位
　　構建了豬GBP1和GBP2的真核表達重組

5、質粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2，轉染PK-15細胞后通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)重組質?？梢哉_表達重組蛋白，其表達蛋白大小約為67kDa;轉染PK-15細胞和Marc-145細胞后通過間接免疫熒光(IFA)檢測，發(fā)現(xiàn)豬GBP1和GBP2蛋白定位于細胞質。
　　4.豬GBP1和GBP2蛋白對PRRSV和PRV增殖的影響
　　使用豬GBP1和GBP2的真核表達重組質粒pCAGGS-HA-

6、GBP1和pCAGGS-HA-GBP2分別轉染PAM和Marc-145細胞，并于轉染后24h接種PRRSVWUH3株(MOI=0.5)，接毒后24h收毒。通過相對熒光定量檢測PRRSV基因組復制情況，通過病毒空斑實驗檢測PRRSV的增殖情況，結果證實豬GBP1和GBP2可以顯著抑制PRRSV的增殖。使用不同劑量的真核表達重組質粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2轉染Marc-145細胞，并于轉染后24h接種PRR

7、SVWUH3株(MOI=0.5)，接毒后24h收毒，通過病毒空斑實驗檢測PRRSV的增殖情況，結果表明豬GBP1和GBP2對PRRSV增殖的影響具有劑量依賴性。
　　使用豬GBP1和GBP2真核表達重組質粒pCAGGS-HA-GBP1和pCAGGS-HA-GBP2轉染PK-15細胞，并于轉染后24h接種PRVEa株(MOI=1)，接毒后18h收毒，通過相對熒光定量和病毒空斑實驗檢測PRV的增殖情況，結果證實豬GBP1和GBP2可以

8、顯著抑制PRV的增殖。使用不同劑量的真核表達重組質粒pCAGGS-HA-GBP1，和pCAGGS-HA-GBP2轉染轉染PK-15細胞，并于轉染后24h接種PRVEa株(MOI=1)，接毒后24h收毒，通過病毒空斑實驗檢測PRV的增殖情況，結果顯示豬GBP1和GBP2對PRV增殖的影響具有劑量依賴性。
　　5.PRRSV和PRV感染對豬GBP1和GBP2的影響
　　使用豬GBP1和GBP2真核表達質粒pCAGGS-HA-GB

9、P1和pCAGGS-HA-GBP2分別轉染Marc-145和PK-15細胞，分別接種PRRSV和PRV后通過間接免疫熒光實驗(IFA)和DAPI核染色，在熒光顯微鏡下觀察，接毒組和對照組中豬GBP1和GBP2均定位于細胞質，這說明PRRSV或PRV感染均不能改變豬GBP1和GBP2的亞細胞定位。
　　以PRRSV感染PAM細胞，PRV感染PK-15細胞，通過相對熒光定量檢測豬GBP1和GBP2mRNA表達情況，結果發(fā)現(xiàn):PRV感染