豬干擾素刺激基因ISG20的克隆、真核表達(dá)及其對(duì)PRRSV增殖的影響.pdf

1、干擾素（Interferon, IFN）是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子，其抗病毒作用是通過誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表達(dá)產(chǎn)生抗病毒蛋白而實(shí)現(xiàn)的。ISG20基因是新近發(fā)現(xiàn)的一種表達(dá)20kDa蛋白的干擾素刺激基因，表達(dá)產(chǎn)物具有核酸外切酶活性，能降解單鏈RNA及DNA，研究證實(shí)在同時(shí)敲除PKR、2',5'-OAS及Mx三個(gè)基因的小鼠成纖維母細(xì)胞中表達(dá)ISG

2、20能抑制水皰性口炎病毒(VSV)的增殖，說明ISG20參與介導(dǎo)IFN的抗病毒作用。
　　 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種單股正鏈RNA病毒，引起豬的繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尋找有效

3、的抗病毒基因?qū)榭筆RRSV品系的培育和PRRS的有效預(yù)防控制創(chuàng)造條件，為此本研究以豬干擾素刺激基因ISG20為研究對(duì)象，對(duì)其在PRRSV增殖中的作用進(jìn)行了初步探討。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.豬ISG20的克隆、序列分析及其進(jìn)化樹的繪制
　　 以PK-15細(xì)胞的cDNA為模板，RT-RCR擴(kuò)增獲得豬ISG20的編碼區(qū)序列，序列分析發(fā)現(xiàn)該基因全長為516bp，可編碼171個(gè)氨基酸殘基，與GenBank上所報(bào)道的豬ISG

4、20氨基酸序列同源性為99％，與牛、狗、人、類人猿、猴、馬、小鼠、大鼠的氨基酸序列同源性分別為：91％、84％、80％、80％、78％、76％、73％、72％。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明：不同物種ISG20之間的氨基酸序列同源性很高，說明ISG20在進(jìn)化中是高度保守的。
　　 2.豬ISG20結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與功能分析
　　 通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬ISG20在6～171位氨基酸之間有3個(gè)Asp(D)殘基、1個(gè)Glu(E)殘基和一個(gè)核

5、酸外切酶功能域，說明豬ISG20屬于DEDD核酸外切酶超家族。此外，在豬ISG20蛋白中，含45.03％的α-螺旋，24.56％的β-折疊和30.43％的無規(guī)則卷曲，這一比例符合α/β折疊蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)比例。以人ISG20的三級(jí)結(jié)構(gòu)為模板，同源建模豬ISG20相應(yīng)區(qū)段的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)豬ISG20與人ISG20的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域非常相似，這提示它的生物學(xué)功能可能與人ISG20相似。
　　 3.豬ISG20的真核表達(dá)及其亞細(xì)胞定位分析

6、r>　　 構(gòu)建了野生型豬及核酸外切酶活性功能缺失突變型ISG20的真核表達(dá)質(zhì)粒，Westernblot分析證實(shí)兩種質(zhì)粒均能有效表達(dá)ISG20。將野生型豬ISG20基因插入pEGFP-C1下游獲得ISG20與EGFP融合的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬ISG20主要位于細(xì)胞核，在細(xì)胞漿內(nèi)只有少量的分布。
　　 4.豬ISG20對(duì)PRRSV增殖的影響
　　 運(yùn)用絕對(duì)定量及TCID50分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)

7、的野生型豬ISG20對(duì)PRRSV的增殖有顯著的抑制作用，而表達(dá)無核酸外切酶活性的突變型豬ISG20對(duì)PRRSV的增殖無影響，說明豬ISG20對(duì)PRRSV的抑制作用依賴其核酸外切酶活性。
　　 5.PRRSV感染對(duì)豬ISG20基因表達(dá)的影響
　　 以PRRSV感染SJPL細(xì)胞，相對(duì)定量RT-PCR分析PRRSV感染對(duì)豬ISG20基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染SJPL細(xì)胞能顯著誘導(dǎo)豬ISG20基因的表達(dá)，因此，我們推測(cè)宿