干擾素刺激基因16(ISG16)的克隆表達及其對丙型肝炎病毒和Ⅰ型干擾素信號通路的影響研究.pdf

1、背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)引起的慢性丙型肝炎是一種嚴重的傳染性肝臟疾病，目前全球感染者約1.5億。感染HCV后，只有20％的感染者可以自發(fā)清除病毒，而且HCV感染造成的慢性化程度較高，是引起肝硬化、肝纖維化以及肝癌的主要原因之一。丙型肝炎的標準治療方法是聚乙二醇干擾素(pegylated-interferon，PEG-IFN)聯合利巴韋林(Ribavirin，RBV)，但是存在療程長、費用高、副作用

2、大等缺陷。本課題組在前期研究中使用基因芯片技術從采用干擾素治療的丙肝患者有效和無效病人肝組織中篩選出18個差異表達基因，其中，在治療無效患者的治療前的肝穿組織中，干擾素刺激基因16(interferon-stimulated gene16，ISG16)呈現高表達。ISG16是最早發(fā)現的能夠被Ⅰ型干擾素誘導的干擾素刺激基因之一，但是ISG16對HCV復制以及Ⅰ型干擾素信號通路的影響還沒有相關研究。
　　目的:在HCVcc體外培養(yǎng)細胞

3、模型（Huh7.5.1細胞）和HCV復制子細胞(Con1b細胞)中高表達ISG16，研究ISG16高表達對HCV復制以及Ⅰ型干擾素抗病毒作用的影響;研究ISG16對Ⅰ型干擾素信號通路的影響;研究ISG16在經干擾素治療后有效和無效的丙型肝炎患者外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的表達差異。最終闡明ISG16在HCV復制，干擾素抗HCV活性，Ⅰ型干擾素信號通路及HCV逃逸宿

4、主先天免疫中的作用。
　　方法:采用基因克隆方法構建ISG16高表達質粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16，轉染Huh7.5.1和Con1b細胞，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Realtime-PCR)檢測ISG16、HCV以及其他ISGs的表達;采用蛋白質印跡法(Western Blot，WB)檢測ISG16蛋白表達和P-STAT1磷酸化水平;采用雙熒光報告基因法檢測干擾素刺激反應元件(interferon-stimul

5、ated response element，ISRE)的活性。以此探討ISG16對HCV復制、干擾素抗病毒作用以及Ⅰ型干擾素信號通路的影響。抽取經干擾素治療后的丙型肝炎患者的靜脈血，分離得到PBMCs，體外培養(yǎng)經Ⅰ型干擾素(IFN-α)刺激后，檢測PBMCs中ISG16的表達水平。
　　結果:構建的ISG16高表達質粒，成功在Huh7.5.1和Con1b細胞中表達;ISG16高表達能夠促進HCV復制，抑制IFN-α抗病毒作用，對Ⅰ

6、型干擾素信號通路中的關鍵點具有明顯影響:延長P-STAT1的磷酸化時間，抑制ISRE活性;在丙型肝炎患者PBMCs中，治療有效和無效之間的本底表達比較發(fā)現，治療無效者本底表達較高，但是由于樣本量較少，結果無顯著性差異，治療有效者經IFN-α刺激后，ISG16表達升高更顯著。
　　結論:ISG16能夠促進HCV復制，抑制IFN-α的抗病毒作用，這種作用可能是通過影響Ⅰ型干擾素信號通路中的關鍵點來實現的;丙肝病毒感染后導致ISG16表