ISG20參與調(diào)節(jié)α-干擾素抗乙肝病毒活性的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　干擾素刺激基因20（ISG20）是一種由I型（IFNα/β）或II型干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，具有特異的單鏈RNA或DNA的核酸外切酶活性，對(duì)于多種RNA病毒和部分DNA病毒均有抑制作用。細(xì)胞內(nèi)定位分析發(fā)現(xiàn)ISG20主要位于核小體和Cajal小體，鑒于核小體是rRNA和核糖體生成的主要場(chǎng)所，Cajal小體是snRNA和snoRNA生成的主要場(chǎng)所，進(jìn)一步提示 ISG20可能通過(guò)其核酸外切酶作用影響snRNA和

2、rRNA的成熟，從而抑制蛋白合成進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用。因此，ISG20的表達(dá)差異及核酸外切酶活性對(duì)于不同病毒感染性疾病的發(fā)病、α-干擾素治療的療效及預(yù)后可能具有重要影響。本研究從臨床試驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩方面觀察ISG20在α-干擾素治療應(yīng)答組及無(wú)應(yīng)答組慢乙肝患者肝臟組織標(biāo)本中的表達(dá)差異與α-干擾素療效的相關(guān)性，并對(duì)其所參與的α-干擾素抗乙肝病毒機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　方法：
　　本研究首先選取接受α-干擾素治療的慢乙肝患者24人，

3、給予聚乙二醇干擾素α-2a（Peginterferon-alpha-2a，派羅欣）抗乙肝病毒治療48周，共隨訪72周，依隨訪結(jié)果分為治療應(yīng)答組及無(wú)應(yīng)答組。對(duì)其治療前肝穿標(biāo)本行免疫組化檢測(cè)觀察ISG20蛋白在各組肝臟組織中的差異表達(dá)并以QRT-PCR加以驗(yàn)證。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們選擇在HBV-DNA全基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2形成的HepG2.2.15細(xì)胞系上進(jìn)行研究，后者是體外研究乙肝病毒對(duì)肝細(xì)胞影響的經(jīng)典模型。通過(guò)構(gòu)建ISG2

4、0過(guò)表達(dá)慢病毒載體感染HepG2.2.15細(xì)胞，觀察ISG20差異表達(dá)對(duì)乙肝病毒活性的影響，驗(yàn)證ISG20的抗乙肝病毒作用;通過(guò)點(diǎn)突變方法構(gòu)建 ISG20去核酸外切酶活性的慢病毒載體，探討 ISG20發(fā)揮抗乙肝病毒作用的機(jī)制是否依賴外切酶活性。分別用QRT-PCR及化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBV-DNA及乙肝表面抗原(HBsAg)及e抗原（HBeAg）評(píng)價(jià)其抗乙肝病毒活性。
　　結(jié)果：
　　免疫組化染色結(jié)果顯示α-干擾素治

5、療應(yīng)答組患者治療前肝組織中ISG20蛋白較無(wú)應(yīng)答組及對(duì)照組顯著升高,且在應(yīng)答組ISG20主要表現(xiàn)為細(xì)胞核高表達(dá)，明顯區(qū)別于無(wú)應(yīng)答組及對(duì)照組。在體外實(shí)驗(yàn)中，加入α-干擾素處理后，ISG20隨著α-干擾素濃度的增加逐漸升高。野生型ISG20過(guò)表達(dá)組可以顯著抑制乙肝病毒，這一結(jié)果與α-干擾素干預(yù)組的結(jié)果相似，并且ISG20過(guò)表達(dá)慢病毒與α-干擾素聯(lián)合干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞后,其抑制乙肝病毒作用顯著增強(qiáng)；而突變型ISG20的外切酶活性失活

6、后，ISG20對(duì)乙肝病毒的抑制作用消失。此外，行免疫熒光檢測(cè)，可見ISG20蛋白高表達(dá)于細(xì)胞核，這一結(jié)果與肝活檢的免疫組化染色結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)ISG20抗乙肝病毒作用主要依賴于其核酸外切酶活性。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)在α-干擾素治療慢乙肝應(yīng)答組及無(wú)應(yīng)答組中，ISG20蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)分布存在顯著差異，提示肝組織內(nèi)ISG20蛋白的差異表達(dá)與α-干擾素治療慢乙肝的療效相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ISG20作為干擾素刺激