豬FoxO1基因cDNA的克隆及其組織表達研究.pdf

1、轉錄因子是控制基因表達的一類蛋白質分子，通過調節(jié)靶基因的表達對機體的發(fā)育和代謝等起重要調控作用。Forkhead(Fox)轉錄因子是2000年才發(fā)布統(tǒng)一命名的一個新的蛋白質家族，在其17個亞家族中，F(xiàn)oxO主要通過轉錄調控和信號傳導途徑在動物的生長發(fā)育，細胞分化、代謝、凋亡和免疫等方面起重要作用。Fox01是Fox0亞家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員，其與成肌細胞分化及脂肪細胞代謝有關，并作為潛在因子參與骨骼肌的分化及I型肌纖維基因的表達，因而是研

2、究肌肉及脂肪組織發(fā)育和代謝的重要候選因子。本實驗以豬為研究對象，從Fox01基因的克隆入手，初步探討Fox01在不同品種豬組織器官中表達規(guī)律，及其在不同類型骨骼肌中的表達情況和可能的調控機理，主要研究結果如下： 1．根據(jù)人、黑猩猩及大鼠等物種Fox01基因同源序列設計引物，利用RT-PCR方法從豬肝臟中克隆了Fox01基因eDNA的部分序列。測序后同源性比對發(fā)現(xiàn)，豬Fox01基因與人、黑猩猩、大鼠、牛和狗的eDNA/芋列顯示分別

3、有87％、87％、85％、87％、和87％的一致性。Genbank的登陸號為DQ673620。 2．組織特異性表達分析表明，F(xiàn)ox01基因在初生豬．(1日齡)和成年豬(9月齡)的肝、肺、腎、脾、心、胃、皮下脂肪、內臟脂肪、背最長肌、股四頭肌和皮肌等組織中均有表達，只是表達豐度隨發(fā)育階段和組織的不同而具有差異。1日齡豬的內臟脂肪中Fox01的表達豐度最高，心臟和骨骼肌中相對較低；而9月齡豬的脾臟中FoxOl相對表達豐度最高，明顯高

4、于免疫機能尚未完全建立的初生豬：另外，9月齡豬的FoxOl表達豐度不僅在平滑肌和骨骼肌中有著顯著差異，而且在不同類型的骨骼肌中也存在顯著差異，顯示出FoxOl的表達可能與骨骼肌類型和運動強度有關。 3．利用實時熒光定量PCR方法進一步定量檢測和分析Fox01基因的分布表明，F(xiàn)ox01在所檢測的組織中表達極不平衡，且在不同日齡豬中表達量變化差異較大，這與SQ RT-PCR的檢測結論相符。分析Fox01基因在1日齡豬心肌、肝臟、骨骼

5、肌、皮下脂肪和內臟脂肪等組織中的表達，發(fā)現(xiàn)Fox01基因在1日齡各組織中普遍表達較高，在與脂肪生成及代謝有關的肝臟、皮下脂肪和內臟脂肪等組織中尤為明顯，提示Fox01基因與脂肪代謝關系密切;Fox01基因在180日齡豬心肌中的表達高于1日齡豬(P/0.05)，在肌肉中的表達與1日齡豬差異不顯著(P>0.05)。 4．以八眉、長白×八眉和長白豬等不同經濟類型豬品種為研究對象，檢測不同類型骨骼肌(比目魚肌、腓腸肌和趾長伸肌)中Fox

6、01 mRNA的表達，結果顯示，不同經濟類型豬品種骨骼肌中Fox01基因mRNA的表達豐度存在顯著差異，即在八眉豬骨骼肌中的表達普遍高于長白豬(P<0.01)，在雜交組合長×八骨骼肌中的表達也高于長白豬(P<0.01)，提示在豬上Fox01也可能負調控骨骼肌的量，F(xiàn)ox01可能是導致脂肪型豬和瘦肉型豬肌肉發(fā)育過程產生差異的主要基因之一。另外F0x01在以Ⅰ型纖維為主的比目魚肌中表達豐度最低(P<0.01)，在以Ⅱ b型纖維為主的趾長伸肌

7、中表達豐度最高(P<0.01)，提示F0x01基因的表達與Ⅰ型肌纖維的含量成反比，F(xiàn)ox01負調控骨骼肌的量和Ⅰ型肌纖維基因表達。 5.檢測不同經濟類型豬肌肉組織中Fox01和MyoD基因mRNA表達的相關性，結果表明：MyoD基因mRNA隨Fox01基因mRNA表達的升高而降低，即Fox01和MyoD基因mRNA表達在肌肉發(fā)育中存在負相關(r=0.728，P<0.05)。Fox01基因在肌肉組織中的上調作用可能是造成的MyoD