豬生長激素基因cDNA克隆與表達效應研究.pdf

1、以豬腦垂體總RNA為模板， 5'-CTAGGATCC CCG GCT GTG ATG GCTGCA-3'(BamHI)和5'-CA GAATTC GCA.ACA GAG ATG CCC AG-3'(EcoRI)為引物，通過RT-PCR克隆了豬生長激素(pGH)基因編碼區(qū)cDNA。豬生長激素基因pGH cDNA ORF編碼216個氨基酸殘基。該cDNA編碼蛋白序列與已有報道的大河豬(Dahe)pGH 100％同源，而與其它地方豬種的pGH

2、前體蛋白序列的同源性為98.6％～99.5％。 豬生長激素基因的原核表達及其抗體制備：將pGH基因亞克隆到原核表達載體pGEX4T-1中，構建了重組原核表達質粒pGEX4T-1/pGH。誘導表達產物的SDS-PAGE分析結果表明出現與預期一致的1條50.4KDa的特異蛋白新帶，重組pGH得到了正確表達。分離包涵體形式表達的融合蛋白GST-pGH，透析得到的重組融合蛋白進行家兔免疫，制備并純化抗pGH的多克隆抗體；經酶聯免疫吸附測

3、定、蛋白質印跡分析和免疫組織化學方法檢測，結果證實制備的抗血清對豬生長激素具免疫特異性。采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化的兔抗pGH多克隆抗體達到SDS-PAGE純；Western Blotting檢測結果表明：豬天然pGH蛋白(24.4 KDa)和融合表達蛋白GST-pGH(50.4KDa)能特異性結合該pGH多抗，豬腦垂體組織的免疫組化分析結果也證實了pGH多克隆抗體的特異性。 通過構建表達質粒pPIC-3.5K/pGH，我們研究

4、了豬生長激素基因在酵母細胞中的表達。將豬生長激素(pGH)基因cDNA編碼區(qū)片斷定向插入pMD18-T質粒，轉化大腸桿菌JM109，用菌落PCR和質粒PCR方法篩選陽性克隆；以BamH I和EcoRI酶切鑒定重組質粒。將重組質粒用BamH I和EcoR I酶切，膠回收目的酶切片斷并定向插入pPIC-3.5K質粒，重組質粒命名為pPIC-3.5K/pGH。該重組質粒經Sail酶切線性化處理后電擊轉化GS115酵母，采用MD和MM培養(yǎng)基篩選

5、重組子，提取初篩重組子的基因組DNA。PCR方法進一步鑒定，獲得的重組酵母菌以甲醇誘導目標蛋白表達，產物經SDS-PAGE和Western-blot分析，復篩得到高效表達pGH的重組酵母，命名為pPIC-3.5K/pGH/GS115。SDS-PAGE和Western-blot分析證明重組酵母誘導表達了pGH蛋白，分子量接近25KDa，與預期的24.4KDa的豬生長激素基因編碼蛋白質大小一致。豬生長激素基因在哺乳動物細胞中的表達：將pGH

6、 cDNA亞克隆到真核表達載體VR1020上，構建了重組真核表達質粒VpGH；利用脂質體法轉染哺乳動物細胞株COS<,7>，分別于24h、48h、72h提取轉染細胞總RNA，對轉染后的COS<,7>細胞進RT-PCR、ELISA和免疫熒光分析。RT-PCR結果顯示轉染細胞24小時總RNA中已含有目的cDNA片段轉錄的對應mRNA；ELISA和免疫熒光分析結果表明重組質粒轉染后的COS<,7>細胞中表達了pGH基因的蛋白產物。 本