人胎盤組織cDNA文庫的構(gòu)建及人生長激素cDNA的克隆.pdf

1、人胎盤組織 c D N A文庫的構(gòu)建及人生長激素c D N A的克隆摘 要c D N A 文庫構(gòu)建和篩選是基因克隆的 重要方法之一， 它是目 前 發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基本工具. 從c D NA 文庫中可以篩 選到目 的基因， 并直接用于該基因的 表達. 經(jīng)典c D N A 文庫存在克隆的片段短等缺點，而全長c DN A文庫則能提供完整的I n R N A 信息，從而能夠克隆出目 的c D N A 的 全長 序列. 本研究以 人胎盤

2、 組織為材料，用 T R I Z o l 試劑提取總R N A ， 以 L D 一 P C R( f o n g 一 d i s t a n ce P c R ) 為 基 礎(chǔ) 構(gòu) 建 c D N A 文 庫 ， 并 對 構(gòu) 建 文 庫 的 質(zhì) 量 作了鑒定， 克隆出 人生長激素c D N A的全長 序列， 為重組人生長 激素的 研究提供了 理論依 據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。獲得如下具體結(jié)果。1 . 稱取l om g組織放入預(yù)冷的 勻漿器中，加 入l

3、 m l 變性劑 們 心 2 0 1 ， 進行勻漿;離心后， 在上清中 加入2 0p l 氛仿抽提， 吸取上清， 加入等體積的 異丙 醇沉淀; R N a s e 一 f r e水重溶沉淀， 加入1 / 1 0體積的乙酸鈉和等體積氯仿反復(fù)抽提， 直到界面間無泡沫狀的蛋白質(zhì)為止;加入等體積的 預(yù)冷的 異丙醇沉淀， 用預(yù) 冷7 0% 的乙醇 漂洗兩次;用3 0 一 5 0協(xié)I DE P C 處理 d d H Z O 溶解沉淀，提取 總R N

4、A ， 一7 0℃保存.2以 T R l z 0 1 試劑提取的 總R N A為模板，以 F ， 、 凡. F 3 、 凡為兩對 特異 性引 物， 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶作用得到 d s 二 D N A。 雙鏈 c D N A 經(jīng)S f il 酶切， T 4 D N A連接酶連接到經(jīng)相同酶切的 J G 4 ， 質(zhì)粒載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細 胞J M 1 0 9 ， 構(gòu)建人胎盤組 織c D N A 文庫。3 . 通過對文庫的容量、重組率以及多樣性進

5、行分析，所構(gòu)建的c DN A文庫容量約為7 . o lx l 護 個 / 協(xié) g d s . C D N A ， 重 組 率 為 9 既 ， 對隨 機 提取 的 1 0 個 克 隆 質(zhì)粒 的 插 入 序 列 進 行分析， 共獲得8 0個不同的c D N A 序列，且未見重復(fù)序列。結(jié)果表明，本方法構(gòu)建的c D N A質(zhì)粒文庫 具有 快速、 簡單、 高 效等特點， 文庫質(zhì)量符合要求， 可用于大 規(guī)模的 基因分 析。4 . 從 人胎 盤組織

6、分離提取總R N A ，利 用R T一 P C R( 一步 法) 方法和從構(gòu)建的c DN A文庫中 提取菌 落質(zhì)粒D N A為模板進行質(zhì)粒 P c R， 均擴增出人生長 激素全長c D N A 序列，進行比較，發(fā)現(xiàn)其序列完全一致。關(guān)鍵詞:胎盤組織;c D N A文庫構(gòu)建;人生長激素;基因克隆:R T ‘ P C Rs u i t a b l e f o r f u nc t i o n a l g e no m i c a n a I

7、y Zi n g ，4 To t a l R N Aw e r ei s o l a t e df r omh u m a n P l a ce nt a t i s s u e ， t h e n u s e d R T 一P C Rt oo b面n t h ef u l l 一 l e n g t hh G H c D N A s 叫 u e n ce . C o m P a r e dt h es e q u e n c ew h

8、i c h o b t a i n e d f r om t h ec o n s t r u c t e dc D N Al i b r a r y u s i n g t h e P C R . T 七 e y w e r e c o n f i r me d b e t h e s a I ne s e qu e n c e ， 5 0c D N Al i b r a r yi s a va i 1 a b 1 e u s i n

9、 g t h i s m e t h o d .K e yw o 川5 : P l a c e n t a t i s s u e ， c o n st r Uc t i o no f c D N Al i b l a r y ， h um a ng r o w l h h o r m o n e ( h G H ) ， G 即e c l o 能，r ev e r s e l r a n s c n Pt a s e P CR ( R