巖原鯉生長(zhǎng)激素基因部分cDNA克隆和表達(dá)研究.pdf

1、巖原鯉Procypris rabaudi(Tchang)屬鯉形目，鯉科，鯉亞科，原鯉屬。只分布于長(zhǎng)江上游及其支流，是長(zhǎng)江上游的一種上等經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，以肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美而聞名于世。近年來(lái)由于其資源遭劍嚴(yán)重破壞，而本種魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)速度較為緩慢，群體得不到及時(shí)補(bǔ)充，故野生群體正趨于逐年減少。在《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》中已被列為易危物種，重慶市也已將其列為保護(hù)魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)，巖原鯉的人工養(yǎng)殖取得長(zhǎng)足發(fā)展，但是，無(wú)論是在自然條件下還是在人工環(huán)境中，巖原鯉的

2、生長(zhǎng)速度緩慢，生活周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增高，風(fēng)險(xiǎn)增大，從而大大的制約了其商品化的進(jìn)程。 生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)是由腦垂體間葉細(xì)胞分泌的一種多肽激素，具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育，參與體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)，增進(jìn)食欲，提高食物轉(zhuǎn)化率等作用。 本研究首次從巖原鯉腦垂體擴(kuò)增出生長(zhǎng)激素部分cDNA序列，并采用RT-PCR的方法分析其組織表達(dá)特性和雌二醇對(duì)其mRNA表達(dá)的影響，主要研究如下： 1.巖原鯉生長(zhǎng)激素部分cD

3、NA序列克隆及同源性分析 在對(duì)多種硬骨魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行了多重比對(duì)后設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性片段引物，以來(lái)自巖原鯉腦垂體的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板擴(kuò)增得到了巖原鯉生長(zhǎng)激素的部分片段序列。 運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)巖原鯉與其他25個(gè)物種的生長(zhǎng)激素cDNA相應(yīng)部分的同源性進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：巖原鯉與其他25個(gè)物種生長(zhǎng)激素cDNA相應(yīng)部分的相似性為81.41％。巖原鯉生長(zhǎng)激素cDNA部分序列與其他魚(yú)類(lèi)具有很高的同源性，

4、相似性最高高達(dá)95.77％，而與兩棲綱的非洲爪蟾(Xenopus laevis)為47.32％，鳥(niǎo)綱的雞(Gallus domestiaus)、鴨(Anas platyrhynchos)分別為50.79％、49.53％，哺乳綱的人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)、家貓(Relis catus)分別為48.13％、52.37％、53.63％、51.42％。 2.巖原鯉生長(zhǎng)激素

5、部分cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析 運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)巖原鯉與其他25個(gè)物種的生長(zhǎng)激素cDNA部分序列推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性進(jìn)行多重比對(duì)，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：26個(gè)物種生長(zhǎng)激素氨基酸的相似性為76.75％。巖原鯉生長(zhǎng)激素氨基酸部分序列與魚(yú)類(lèi)具有很高的同源性，相似性高達(dá)94.23％，而與兩棲綱的非洲爪蟾(．Xenopus laevis)為33.33％，鳥(niǎo)綱的雞(Gallus domestiaus)、鴨(Anasplatyr

6、hynchos)分別為35.24％、35.24％，哺乳綱的人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)、家貓(Felis catus)分別為32.08％、36.19％、39.05％、37.14％，而相應(yīng)片段哺乳綱的相似性高達(dá)88.46％。 3.生長(zhǎng)激素的組織特異性表達(dá)研究 根據(jù)得到的部分cDNA序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)用于表達(dá)研究的特異性引物。此外，根據(jù)斑馬魚(yú)的B-actin序列設(shè)

7、計(jì)了一對(duì)內(nèi)參引物。PCR結(jié)果顯示：生長(zhǎng)激素基因在垂體、肌肉、鰓、腎、眼組織都有表達(dá)。其中生長(zhǎng)激素基岡在垂體的相對(duì)表達(dá)量最高，在肌肉、鰓、腎、眼中表達(dá)較低，而在肝臟中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。 4.雌二醇對(duì)生長(zhǎng)激素mRNA表達(dá)的影響研究 設(shè)計(jì)了每千克魚(yú)體1mg、5mg、10mg濃度的雌二醇組和一個(gè)生理鹽水組，分別在腹腔注射48h、72h、96h后取樣，采用：RT-PCR的方法對(duì)生長(zhǎng)激素mRNA表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示：雌二醇對(duì)