鰈形目魚類生長(zhǎng)激素基因的克隆及牙鲆生長(zhǎng)激素在釀酒酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、本論文克隆了9種鰈形目魚類的生長(zhǎng)激素基因cDNA序列并運(yùn)用PAUP軟件進(jìn)行了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，構(gòu)建了四種不同類型的釀酒酵母(Sacharomycescerevisiae表達(dá)牙鲆生長(zhǎng)激素的載體，并研究了牙鲆生長(zhǎng)激素基因在釀酒酵母中的表達(dá)情況。 從7種重要鰈形目經(jīng)濟(jì)魚類——高眼鰈(Cleisthenes herzenstein)、黃蓋鰈(Limanda yokohamae)、木葉鰈(Pleuronichthys Cornutus)

2、、寬體舌鰨(Cynoglossus robustus)、石鰈(Platichthys bicoloratus)和條鰨(Zebrias zebra)、夏鲆(Paralichthysdentatus)的腦垂體中提取mRNA,并采用RT-PCR方法，根據(jù)已克隆得到的鲆鰈魚類生長(zhǎng)激素基因的保守性序列設(shè)計(jì)特異性引物，克隆了含開放閱讀框的生長(zhǎng)激素(Growth Hormone，GH)cDNA序列，測(cè)序結(jié)果顯示，高眼鰈、黃蓋鰈、木葉鰈、寬體舌鰨、石鰈

3、、條鰨和夏鲆的GH cDNA長(zhǎng)度依次為479 bp、564 bp、519 bp、440 bp、564 bp、440 bp和522 bp，編碼140-170個(gè)氨基酸的成熟GH多肽片段；從漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)腦垂體中提取mRNA，利用SMART-RACE技術(shù)建立腦垂體cDNA文庫(kù)，并從該文庫(kù)中克隆出大菱鲆和漠斑牙鲆生長(zhǎng)激素基因cDNA全長(zhǎng)序列。測(cè)序結(jié)

4、果表明，克隆的大菱鲆GH cDNA序列全長(zhǎng)為876 bp，包括108 bp的5’UTR和1174 bp的3’UTR序列，開放閱讀框全長(zhǎng)591bp，編碼由197氨基酸殘基組成的生長(zhǎng)激素成熟肽序列，漠斑牙鲆GH cDNA序列全長(zhǎng)為902 bp，包括l31 bp的5’UTR和198 bp的3’UTR序列，開放閱讀框全長(zhǎng)570 bp，編碼由190氨基酸殘基組成的生長(zhǎng)激素成熟肽序列。運(yùn)用PAUP軟件對(duì)15種鰈形目魚類與另外7種不同種屬魚類進(jìn)行了分

5、子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化特征分類進(jìn)化地位基本一致，在15種鰈形目魚類中只有大菱鲆和塞內(nèi)加爾鰨各自單獨(dú)形成一個(gè)分支且與鲆科和鰈科魚類相距較遠(yuǎn)，其中塞內(nèi)加爾鰨等種類的分類地位與根據(jù)線粒體DNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)生模式基本吻合。說明生長(zhǎng)激素基因可以有效地用于研究鰈形目等硬骨囪類的親緣關(guān)系及分類地位。 通過將牙鲆生長(zhǎng)激素基因，插入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示載體pYD1中，構(gòu)建

6、了非整合型載體pYD-GH，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了三種整合型載體：適合于細(xì)胞外誘導(dǎo)表達(dá)的pYD-E2、細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的pYD-E4和細(xì)胞內(nèi)組成表達(dá)的pYD-EP4。將載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌株EBYl00中，得到轉(zhuǎn)牙鲆生長(zhǎng)激素釀酒酵母，對(duì)牙鲆生長(zhǎng)激素在釀酒酵母中的表達(dá)和生物學(xué)活性進(jìn)行了研究。非整合型載體pYD-GH無法在酵母細(xì)胞的傳代中穩(wěn)定存在而整合型載體pYD-E2、pYD-E4和pYD-EP4經(jīng)過30代后的陽性檢出率為100％，證明通過同源

7、重組目的基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到酵母基因組。對(duì)細(xì)胞外誘導(dǎo)表達(dá)的pYD-GH和pYD-E2轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行熒光標(biāo)記，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析外源基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示半乳糖誘導(dǎo)6小時(shí)的轉(zhuǎn)化酵母即具有最高的熒光強(qiáng)度而12小時(shí)的轉(zhuǎn)化酵母仍具有較高的熒光強(qiáng)度。經(jīng)過計(jì)算，牙鲆生長(zhǎng)激素在GAL為啟動(dòng)子的胞外表達(dá)工程菌E2中的表達(dá)量為1.02‰，在GAL為啟動(dòng)子的胞內(nèi)表達(dá)工程菌E4中的表達(dá)量為1.49％0，而以PGK為啟動(dòng)子的胞內(nèi)表達(dá)工程菌EP4的表達(dá)量為1

8、.93‰。對(duì)表達(dá)了牙鲆生長(zhǎng)激素的釀酒酵母進(jìn)行生物活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)E2、E4和EP4在促進(jìn)牙鲆生長(zhǎng)、提高餌料轉(zhuǎn)化率方面均有顯著的作用，即使添加量?jī)H有0.5％，在7周時(shí)間里體重增長(zhǎng)分別比商品飼料對(duì)照組提高了27.16％、26.76％和31.21％，餌料轉(zhuǎn)化率比對(duì)照組分別提高22.75％、22.34％和26.15％，隨著釀酒酵母添加量的增加，作用更加顯著，當(dāng)釀酒酵母添加量達(dá)到1％，轉(zhuǎn)基因釀酒酵母(E2、E4、EP4)組魚的體重增長(zhǎng)分別比商品飼料

9、對(duì)照組提高了47.29％、46.87％和50.24％，餌料轉(zhuǎn)化率比對(duì)照組分別提高30.65％、30.46％和32.07％。最后為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)牙鲆生長(zhǎng)激素基因酵母的安全性，將轉(zhuǎn)基因酵母灌胃昆明種小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)、傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)、骨髓微核和精子畸形試驗(yàn)，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)牙鲆生長(zhǎng)激素基因的釀酒酵母對(duì)小鼠均不具有毒性(LD50>10g/10/kg)。另外在傳統(tǒng)致畸試驗(yàn)、骨髓微核和精子畸形試驗(yàn)和小鼠組織器官影響實(shí)驗(yàn)中三種轉(zhuǎn)基因釀酒酵母的三個(gè)劑量