黑斑蛙Dmrt1和Sox9基因cDNA序列的克隆研究及其精巢組織cDNA文庫的構建.pdf

1、性別是一個高度保守的性狀，但是不同進化地位的物種控制性別發(fā)育的分子機制卻不盡相同。哺乳類中有雄性性別決定因子Sry基因(Sex-determiningregion of Y chromosome,Sry)，而在非哺乳類的脊椎動物中卻缺少Sry基因。因此，研究非哺乳類動物的性別決定和分化相關基因具有重要意義。黑斑蛙是兩棲動物，分布廣泛，是研究性別發(fā)育分子遺傳機制的良好模式動物。
　　Dmrt1和Sox9基因分別是Dmrt(Doubl

2、e-sex and Mab-3 related transcriptionfactor)和Sox(SRY related HMG-box gene)基因家族的成員。作為參與發(fā)育的基因家族，這兩個家族在系統(tǒng)進化上高度保守，在胚胎發(fā)育分化、組織器官的形成及相關功能的維持、性別決定和分化等中都具有重要的作用。Dmrt1主要表達于脊椎動物成體的精巢中，在所有脊椎動物中對誘導精巢的正常發(fā)育起著至關重要的作用。Sox9基因高度保守，參與性別決定，誘

3、導足細胞的發(fā)育，而且還參與骨、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管的發(fā)育。
　　為進一步研究Dmrt1基因和Sox9基因，本文采用SMART技術(switchingmechanism at5’end of RNA transcript)獲得了黑斑蛙精巢組織雙鏈cDNA。用RACE(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)和RT-PCR(Reversetranscription PCR, RT-PCR)的方法克隆了

4、Dmrt1基因的全長cDNA及Sox9基因的cDNA序列。經(jīng)過拼接后獲得的Dmrt1序列為全長cDNA，由1807個核苷酸組成，其開放閱讀框ORF包含1005bp，能編碼334個氨基酸；5’UTR(非翻譯區(qū))為87bp，3’UTR為712bp。通過BLAST與Genbank上的已知序列進行相似性檢索，本文獲得的黑斑蛙Dmrt1核苷酸序列與粗皮蛙(Rana rugosa)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapie

5、ns)、鼠(Mus musculus)分別具有93％、71％、66％、66％相似性，其推導的氨基酸序列與上述物種具有93％、77％、76％、76％的同源性。通過RT-PCR技術獲得黑斑蛙Sox9基因的cDNA序列由1448個核苷酸組成，其開放閱讀框ORF含有1446bp，能編碼481個氨基酸。通過BLAST與Genbank上的已知序列進行相似性檢索比對，發(fā)現(xiàn)黑斑蛙Sox9序列與其他物種具有較高的相似性，其核苷酸序列與粗皮蛙，中華大蟾蜍(

6、Bufo bufo gargarizans)、西方爪蟾(Xenopus tropicalis)、非洲爪蟾、密西西比鱷(Alligator mississippiensis)、人、鼠、雞(Gallus gallus)分別具有94％、87％、83％、82％、81％、81％、80％、79％的相似性，推導的氨基酸序列與上述物種的一致性分別為96％、93％、91％、90％、85％、80％、81％、84％。ClustalX比對結果也顯示這兩個基因在

7、動物系統(tǒng)進化上具有較高的保守性。本文研究結果顯示，黑斑蛙Dmrt1和Sox9基因在成體黑斑蛙精巢組織中表達。
　　另外，本文還構建了黑斑蛙精巢組織的cDNA文庫。經(jīng)檢測原始文庫的滴度分別為2.0×106 pfu/mL和2.4×106 pfu/mL，擴增后的文庫滴度為0.48×109pfu/mL和3.0×109 pfu/mL，重組率均在90％以上。其插入片段平均長度約為1.0kb。挑取一陽性克隆分別從5’端和3’端進行測序,得到一長