寧RS-1 SSH cDNA文庫構(gòu)建和PGIP基因克隆及其表達載體構(gòu)建.pdf

1、油菜（Brassica napus）是我國四大油料作物之一，菜籽油更是我國主要的食用植物油。菌核病是油菜的重要病害，它是由核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)侵染植株引起的莖、枝腐爛，導致油菜產(chǎn)量損失。一般年份可致減產(chǎn)5％左右，發(fā)病嚴重年份可導致油菜減產(chǎn)30％或更多。目前，十字花科及其近緣植物中尚未找到抗菌核病基因。因此，育成的油菜品種中還沒有對于菌核病表現(xiàn)高抗或免疫的抗病品種。由于缺乏抗病基因資源，油菜菌核病抗病育

2、種遇到了困難，尋找與致病或抗病相關基因，無疑對菌核病的防治有著重要意義。
　　 菌核病屬于真菌性病害，真菌在侵染植物時首先分泌一種多聚半乳糖醛酸酶(PG)，PG對植物細胞壁的降解使其他細胞壁降解酶對其底物的攻擊更加容易，并為真菌的生長和發(fā)育提供糖源。PGIP，是一種多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白，能夠特異性識別并抑制真菌分泌的PG的活性，從而抵抗真菌的侵染。
　　 本研究以油菜中抗品系甘藍型油菜寧RS-1為植物材料，以南京油菜

3、田里收集的核盤菌為致病菌進行研究。研究中構(gòu)建了經(jīng)核盤菌誘導后寧RS-1抑制消減cDNA文.庫；此外，克隆了寧RS-1的BnPGIP基因，構(gòu)建了BnPGIP-pCABIMA組成型表達載體，并通過半定量PCR技術(shù)進行初步分析。研究內(nèi)容如下：
　　 一：本研究以甘藍型油菜寧RS-1為材料，分別提取經(jīng)核盤菌誘導前后的寧RS-1葉片RNA，然后純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過酶解后加接頭，接著進行了兩次雜交，最后構(gòu)建了經(jīng)核盤菌誘導后寧

4、RS-1差異表達的抑制消減cDNA文庫，其中正向消減文庫是以誘導后的寧RS-1cDNA為tester，以正常的寧RS-1cDNA為driver;反向雜交文庫則相反。所構(gòu)建的文庫重組率均達到95％，文庫容量均達到2700，表明所構(gòu)建的文庫質(zhì)量良好，能夠滿足下一步篩選抗菌核病基因。對隨機挑取的克隆進行測序分析，獲得了許多跟抗病、代謝有關的基因，如r-谷氨半胱氨酸酶基因，抗真菌蛋白基因，鐵蛋白基因，ACC氧化酶基因等，為進一步展開油菜抗菌核病

5、重要功能基因的克隆和鑒定提供了重要基礎。
　　 二：根據(jù)已經(jīng)報道的油菜PGIP基因序列，設計簡并引物，從寧RS-1基因組DNA中PCR克隆到一條序列，該序列包含一個內(nèi)含子與兩個外顯子，經(jīng)過序列比對分析，與已公布的油菜PGIP1基因的氨基酸序列同源性高達98％，編碼區(qū)序列全長984bp，編碼332個氨基酸，富含亮氨酸。同時還構(gòu)建了寧RS-1PGIP-pCABIMA組成型表達載體，為研究轉(zhuǎn)BnPGIP基因油菜的抗病性，開辟了油菜抗菌