蘋果[maluspumilamill.]s6pdh基因cdna的克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建

1、西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文蘋果[Malus pumila mill.]S6PDH基因cDNA的克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建姓名：梁東申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：馬鋒旺;張軍科20040601C l o n i n go fS 6 P D H c D N A f r o mA p p l e [ M a 脅s p u m i l aM i l l ．Ja n d C o n s t r u c t i o no f I t sP

2、 I a n t E x p r e s s i o n V e c t o rA B S T R A C TS o r b i t o l i s t h e m a j o rp h o t o s y n t h e t i cp r o d u c t 、t r a n s l o c a t i n gs u g a ra l c o h o l a n ds t o r a g ec a r b o h y d r a t

3、ei n R o s a c e a ep l a n t s ，t h er o l e s o r b i t o l p l a y e di s l i k e s u c r o s e i no t h e rp l a n t s ．A sl o w —m o l e c u l a r - w e i g h to s m o t i cc o m p o u n d s ，i tC a na d j u s t i n

4、 f i l t r a t i v el e v e l ，S O i t ’S c o r r e l a t e dw i t hr e s i s t a n c e ．I na d d i t i o n ，f r u i tf l a v o ri sm o s td e p e n d e n to ns u g a rt y p e s t r a n s f o r m e df r o m s o r b i t 0

5、 1 ．E n z y m ep l a y st h em o s t i m P o r t a n tr o l e i ns o r b i t o lm e t a b o l i s m ．S 6 P D H i st h ek e y e n z y m e f o rt h e b i o s y n t h e s i so f s o r b i t 0 1 ．w h i c hc a t a l y z e dt

6、h ec o n v e r s i o nb e t w e e n g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t ea n d s o r b i t o l 一6 - p h o s p h a t e ．S ol o t so f w o r kh a s d o n eb ym a n y r e s e a r c h e r s ，a n dg a i nl a r g e p r o g r e

7、 s s ．T h ea i m o f t h es t u d yi s t o l a yf o u n d a t i o n s f o rt r a n s f e r r i n gt h eg e n ee n c o d i n gS 6 P D H ，b y m e a n s o fc l o n i n g a n d s e q u e n c e a n a l y s i s o f S 6 P D Hg

8、e n e a n dc o n s t r u c t i n g o f t h e p l a n te x p r e s s i o n v e c t o r ．A tf i r s t ，t h et h r e em e t h o d s w e r ea d o p t e d t oe x t r a c tR N A f r o ma p p l e l e a v e s ．T h er e s u l t s

9、 s h o w e dt h a t t h r e em e t h o d sw e r e a l l s u i t a b l e f o rR N A e x t r a c t i o n ．T h ef i r s tm e t h o d i s t h es i m p l e s t o n e ．S e c o n d ，t h e f a c t o rt h a ta f f e c tR T - P C

10、R w e r e s t u d i e da n d h i g h l y e f f i c i e n t R T - P C Rd e t e c t i o n s y s t e m w a se s t a b l i s h e d a n d o p t i m i z e d ．A s f o r t h e 2 0u 1 R Ts y s t e m ：d N T P s ( 2 r n r n o l ／L

11、) 2 。5 u t 5 ×B u f f e r 4 u l ；R N a s i n ( 5 0 U ／u 1 ) ll a l ；O l i g o ( d T ) ( 1 0 t 。1 m o l ／L )0 ．5r q ；t e m p l a t eR N A 4 l a l ；M o - M L VR t a s e ( 2 0 0 U ／u 1 ) l l a k A sf o r t h e 2 5M P C

12、 R s y s t e m ：d N T P s ( 2 m m o l ／L ) 5u t l O X B u f f e r 2 ．5 M ；M g C l 2 ( 2 5 m r n 0 1 ] L ) 2 ．4 M ；L D 0 3 ( 1 0 I t m o Y L )2 v J ；L D 0 4 ( 1 0 u m o l ／L ) 2 v l ；T a q D N A p l o y m e r a s e ( 5 U

13、／l 上1 ) Q 3 p 上e D N A 4 u lT h i r d ，t h e s p e c i a l f r a g m e n t o fR T —P C Rw a su s e dt o c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i s ．T h e e D N A o f S 6 P D H c l o n e d f r o m a p p l e l e a v

14、e s ，c o n s i s t e d o f9 3 0 b p ，e n c o d i n g ，ap r o t e i no f3 10 a m i n o a c i d s ．O b t a i n e ds e q u e n c e W a s c o m p a r e dw i t ht h a to fK a n a y a m a ’Sr e s e a r c h ．t h e r ew e r e4d

15、i f f e r e n tb a s e si n9 3 0 n u c l e o t i d e s ．T h e r ew a so n l yo n ed i f f e r e n ta m i n o a c i d d u et oc o d ed e g e n e r a c y ．S i m u l t a n e i t y , r e s t r i c t i o ns i t e sa n a l y s

16、 i sw a sd o n e ．F i n a l l y ，t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp B I S W a sc o n s t r u c t e dc o n t a i n i n g c o m p l e t eS 6 P D He D N Av i ap U C m - r Ta n dp G E m ·- 7 Z f , a n d c o m