農(nóng)桿菌介導(dǎo)s6pdh基因轉(zhuǎn)化棗樹zyziphusjujubemill.的研究

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo) s 6P D H基因轉(zhuǎn)化棗樹 ( 乃 憶 i P h u sj u j ub eM i l i . )的 研究摘 要棗樹 ( 馬 億 i P h u sj l 歹 祝 b o Mi l i) 是我國的一個特色經(jīng)濟(jì)林果，也是棗區(qū)人民 脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。我國棗樹主栽區(qū)多處于干旱與半干早的山區(qū)與平原，紅棗的產(chǎn)量和品質(zhì)長期受到干早、鹽堿、低溫等不利條件形成的非生物性環(huán)境造成的 脅迫限 制。非生物性 脅迫主要體現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi) 外的 滲透

2、壓的改變，細(xì)胞通過積累一些小分子物質(zhì)來調(diào) 節(jié)這種滲透不平衡，山梨醇就是這種具有細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力的小分子有機(jī)物質(zhì)。s 6P D H( s o r b i t o l一 6 一 P h。 印 h a t e d eh yd r o g e n a s e ) 是與山 梨醇代謝有關(guān)的最關(guān)鍵的 酶之一，可調(diào)節(jié)山梨醇在植物體內(nèi)的合成。本研究擬從棗樹葉片離體再生體系研究入手，以建立根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化體系，將S 6 P D H基因?qū)霔棙?，使?/p>

3、樹也具有合成山梨醇的能力。本研究獲得主要結(jié)果如下:1 建立了 木棗離體葉片 不定 芽高效直接再生 體系。1 . 1通過多因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，研究了影響木棗、狗頭棗、團(tuán)棗離體葉片不定芽直接再 生的因 素。 試驗(yàn)結(jié)果 顯示， T D z可高效的誘導(dǎo)不定芽再生，而 B A 效果甚微;愈傷組織褐化是影響不定芽分化的主要因素;外植體在同一培養(yǎng)基上持續(xù)培養(yǎng)，不定芽點(diǎn)很難發(fā)育成正常莖芽。木棗葉片在培養(yǎng)基 ( M S + l o m g 幾 T D z

4、+0 . s m 留 LI BA )上不定芽最高再生頻率達(dá)7 3. 3 %，狗頭棗、團(tuán)棗 ( 培養(yǎng)基為 MS + 2. o m創(chuàng) LT D z + 0. 4 m 留 LI BA)最高達(dá)到了7 6. 7 %，木棗最高再生頻率要顯著低于狗頭棗和團(tuán)棗最高再生頻率。選擇木棗為研究材料，對不定芽再生進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化研究。1 . 2在再 生培養(yǎng)基 ( MS + l. O m 留 L T D Z + 倉 s m 叭 I BA )中 添加A g NO 3

5、可以 顯著的 提高木棗葉片再生頻率并減輕褐化， A g N0 3 濃度為 s m 創(chuàng) L時不定芽再生頻率最高達(dá)到9 4 . 4 %。 在培養(yǎng)基中 添加P V P 、 V c 不能 顯著促進(jìn)不定 芽再生， 添加A C( 活 性炭) 則不利于器官分化。1 . 3培養(yǎng)初期暗 培養(yǎng)對于木棗葉片 不定芽的 分化是 非常重要的， 暗培養(yǎng)時間為 Z l d為宜;生根試管苗葉片相對于莖段增殖苗葉片更能高效穩(wěn)定的誘導(dǎo)不定芽再生。經(jīng)過系 統(tǒng)優(yōu)化， 木棗葉片

6、不 定芽再 生頻率最高 達(dá)9 8. 3 % 。1 . 4通過適時轉(zhuǎn)接繼代可以促進(jìn)不定芽的發(fā)育和生長，轉(zhuǎn)接繼代的時間應(yīng)該選擇在不 定 芽 點(diǎn) 出 現(xiàn)階 段 。 轉(zhuǎn)接 至 繼 代 分 化 培 養(yǎng) 基 ( M s + 0 . l m 昨 T D z +0 . 2 m 留 L I B A ) 上 可以形成簇 狀不定芽團(tuán)， 而在培養(yǎng)基 ( M S + 0 . 6 m 叭 B A +0 . Z m 妙 I BA )上形成很多形態(tài)正 常的不定 稍，

7、每個葉片再生的不 定芽數(shù)量最高 達(dá)8 . 3 個。1 . 5分化獲得的不定芽在增殖培養(yǎng)基 ( MS + l. Z m目 L B A 十 住 Z m刃 LI BA)上繼代繁殖S T U DYONA G R OB 刁 C 幾沃I U幾 吞 ME D I A T E D T R ANS F O RMA T I ONOFZ } 2滬HU夕 J 乙 了 口 萬 石WI T H S 6 P DHGE NEABS T RACT為 憶 i P h u

8、sj u j u b e M i l l . i s a n a ti v e f r ui t c r o p w i t ha n i m p o r t a n t e c o n o m i c a l a n d e c o l o g i c a lv a l u e i n C h i n a. T h e f r u i t w a s w id e l y f a v o r i t e d t o C h i n e

9、s e ， e a s t e mA s i a n， s o u th e a s t e mA s i a n，P r e s e n t ly ， C h i n e s e d a t e w as m o s t l yc u 1 t u r e d i n t h e H ua n g h e形 v e rv a l l e y ，m o s t o f t h e c ul t u r a la r eaw a s a t

10、r i b u t e dt o s e m i 一 麗d i t y a nda r id i t y ，s a l t e ds o i l ， l o wt e n 1 P e r a tu r e a ndd r o u g 】 I te n v i r on m e n t ，w h l c h c o n t r i b u t ed t o l o w y i e l d ，c o a rs e q u a l l t y

11、 a n d l o w 一 d eg r e e o fh o r t i c u l t u ra l i z a t i o n . A l l t h e s eb a d c o n di t i o n s c o u l dl e a d t on o n 一 b i o l o g i c a ls t r es sT h e s t r es sw as c a us e db yt h eo s mo t i cu

12、n b a l a nc e b e t w e e n i n t r a c e l l u l a ra nde x t r a c e l l u l a r . P l a n t c e l l c a na cc u m u l a t es o m el o w w e i g h t s u bs t a nc et oa l l e v i a t et h es t r es s ， s u cha s s o r

13、 b i t o l . S o r b i t o l 一 6 -P h os P h a t e d e 勿d r o g e na s e ( S 6 P D H ) i s c o n f i r me d a sa k ey r o l e i n t h e b i o s y n t h e s i s o f s o t h i t o l i n R os a c e a e. I n o u rr e s e a r

14、 c h ， i n i t i a l l y ， w e P r e Pa r e t oc o n s t n j c t a r e 羅 n e r a t 1 0 ns y s t e mf r om v i t r o l e a ve s o f j u j u be . A n d t h e n ， A g ro b a c t e r i u m一 m e d l a 撫 d g e ne t i c t r a n

15、 s f o r ma t i o n s y s t e mw a ss t u di e da ndo b t a 1 nt h e t r a n s f o r ma n t o f j u j u b e c o n ta i n i n g S 6 P D Hg en e i n t he e ndT he r e f or e，j u j u be t r ee w o u l db e g i v e n t 1 1 e

16、 a bi l i t y o f s y n t h e s i z i n gs o r bi t o l i n c r e a s i n g t h e r e s i s t a n t a bi l i t yo f j u j u be t r ee f o r o s m o t i c s t re s s . T he ma i n r e s u l t s o f t h e e x Pe r i m en t

17、s a r e a s f ol l o w s .1 . R eg e n e r a t i o n s ys t e mo f i n v i t ro 1 e a v e s o f Mu sa o j u j u b e w as c o I 1 s t r uc e d .1 . l T h r o u g h ae x P e r i m e n i W it hr a n d o m b l o c k s d es i

18、 g n， t h ea d v e n t i o u s b 幾 I dd i r e c t l yr e g e n e r a te df r Omi n v 1 t r o l e a ve s o f t h r e e c u I t i v a r es w a s i n i t i a l l ys t u d i e d . T h e r e s e 暇hr e s u l t s s h o w ed t h

19、 a t T D Zc a nh i g h e f ic i e n ti n d u c e t h e r e g e n e r a t i o n o f a d v e n t it i o us b u d f r oml e a v e s ， b y c o n t r a s t ， B Ad i d n， t h a v es oe f ec t . D u r in gt h e p r o c e s so f

20、 r e g e ne r a ti o n ， T h e b r o w n戶e n o m e n o no fc a l l u s w a so n eo ft hek e yf a C t o r st od e c r ea s e t h e a d v e n t i t i o u s b u d r e g e n e r a t i o n a bi l i t y ，m ea n w h l l e ， t h

21、 e a d v e n t i t i o u s b u d h a r ed i y n or ma l l y d e v e l o P i n i o s h o o t 二T h e 祀s e a r c h r e s ul t s a l s o s h o w ed t h a tt h e h i g h e s tr e g e n e r a t i o n P e nc e n ta g e o f M u

22、Z a o ， o nt he r eg e n e r a t i o nm e di u m ( MS + 1 . o m g / LT D Z + 0 . s mg 幾I B A ) ， r e a ch ed7 3 . 3 %， a nd 7 6 . 7 %f o rG o u t o u z a o a ndT ua n z a o o nt h e m e d i u m ( MS + 2. O n l g 毛T D Z +

23、 0 . 4 m g 幾 I B A ) ， t he f o m e r w a s s i g ni f i c a n tl y l o w e r t h a n1 a t 1 e r t wo c u h i v a r e s o n t h eh i g h e s t r e g e n e r a ti o n f r eq u e n c y . 認(rèn) 七 t h e ns t u de d t h er e g e

24、ne r a ti o n s ys t e mo n Mu za o i nd e t a i1 .1 . Z A g N0 3 s u PP l e m e n t e d t ot h eMS m e d i u m ， c o n i a i n i n g l . o m g / L T D Za n d o . s m 留 L I B A， h a s as i g n i f i c a n t e 月 七 c t o n

25、l i g h t e n i n gb r o w n ，t h er e g e n e r a t i o n e f i c i e n cy w as a l s oP r o m o t e dt o9 4 · 4 % B yc o n t r a s t ， P V Pa ndV ca dd e dt o t h e a bo v em e d i u x n d i d n， t h el Pt od i f

26、er e n t i a t i o n o f t h e a dv e n ti t io u s b u d ， A Cw a s h a n 刀 佃 t o c a l l u s d i f er e n t i a t i o n .1 . 3I n比ei n i ti a lc l l l t l r es t ag e ， d a r kP e r i o dw a sc r i t ic a lf o r t h ed