巨桉低溫脅迫SSH EST文庫構(gòu)建及CBF基因的克隆和表達分析.pdf

1、桉樹原產(chǎn)于澳大利亞，生長迅速，木材用途廣泛，且能提取具有藥用價值的桉油等，已成為世界上最為廣泛種植的闊葉樹種之一。在我國，桉樹己成為熱帶和南亞熱帶地區(qū)最重要的速生用材樹種。在浙江沿海，桉樹可作為沿海防護林和景觀綠化樹種。但大多數(shù)桉樹屬于冷敏感樹種，在氣候變化異常的今天，低溫常常給桉樹種植帶來不利影響。為研究桉樹抗寒的分子機制，促進其抗寒相關(guān)的分子輔助育種，培育高抗品種應(yīng)對低溫危害，本研究以巨桉為材料，利用SSH(suppressjons

2、ubtractivehybridization)技術(shù)，構(gòu)建了其低溫脅迫下的EST(expressingsequencetag)差減文庫，初步分析了低溫誘導的相關(guān)基因。同時，針對植物在低溫脅迫中起重要作用的CBF基因，用同源克隆的方法在低溫處理的巨桉材料中進行了分離。并對克隆得到的巨桉CBF基因進行低溫等逆境條件下的表達分析，初步研究了它們在巨桉抗低溫等逆境中的功能。本文研究結(jié)果為桉樹的抗寒遺傳改良奠定了理論基礎(chǔ)。取得的主要研究成果如下:

3、
　　 采用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)，構(gòu)建巨桉在低溫(4℃)黑暗(Tester)和常溫(25℃)黑暗(Driver)條件下處理2h的表達基因差減EST文庫。通過對文庫的測序，獲得了280個高質(zhì)量序列。經(jīng)功能注釋，發(fā)現(xiàn)其中包含脂肪酸去飽和酶基因、信號肽酶和Zn2+依賴蛋白基因等與巨桉低溫誘導相關(guān)的基因。在文庫基因篩選過程中，發(fā)現(xiàn)編號為88（脂肪酸去飽和酶基因）和93（鋅指蛋白基因）的兩個序列，在低溫誘導下表達量明顯上調(diào)，表達量分

4、別為對照的22倍和27倍，說明了文庫構(gòu)建的有效、可用。
　　 利用同源克隆方法從低溫誘導的巨桉幼苗中克隆到2條CBF的全長cDNA序列，命名為EgrCBF1和EgrCBF2，全長分別為1062bp和1203bp，編碼220個氨基酸和196個氨基酸，都包含一個AP2結(jié)構(gòu)域。兩個基因編碼的蛋白都與岡尼桉中CBF蛋白具有很高的同源性，與EguCBF1a的同源性分別達到了91％和80％。
　　 對EgrCBF1和EgrCBF2基