尾巨桉揮發(fā)油含量測(cè)定及HMGR基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、桉樹揮發(fā)油是世界產(chǎn)量最大的精油之一，廣泛運(yùn)用于制藥、香料和工業(yè)行業(yè)。目前，國(guó)際市場(chǎng)的桉樹揮發(fā)油基本全部由中國(guó)提供，一方面人們對(duì)桉樹揮發(fā)油的需求越來(lái)越大，另一方面桉樹揮發(fā)油的產(chǎn)率卻低至1％左右，目前通過(guò)基因工程提高桉樹揮發(fā)油產(chǎn)率是一個(gè)有效的措施之一。因此，本研究提取尾巨桉不同組織的揮發(fā)油并對(duì)其中的1,8-桉葉素和β-桉葉醇含量進(jìn)行測(cè)定;同時(shí)克隆了尾巨桉樹揮發(fā)油代謝途徑上的相關(guān)基因，為尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化和揮發(fā)油含量檢測(cè)提供理論依據(jù)。
　　

2、 本研究使用Clevenger apparatus分別提取尾巨桉根、莖和葉組織揮發(fā)油，結(jié)果表明葉的揮發(fā)油產(chǎn)量最高，其總油量為252.6mg·100g-1，出油率為0.25％；莖的總油量為18.2 mg·100g-1，出油率為0.018％，根中沒有揮發(fā)油存在。經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)表明，1,8-桉葉素在葉和莖揮發(fā)油總量中分別占0.06％和0.04％；β-桉葉醇在葉和莖揮發(fā)油總量中分別占6.69％和11.5％，說(shuō)明β-桉葉醇是尾巨桉揮發(fā)油的主

3、要成分之一，1,8-桉葉素含量相對(duì)較低。
　　 桉樹揮發(fā)油由單萜和倍半萜類化合物組成，通過(guò)甲羥戊酸(MVA)途徑和甲基赤蘚醇4-磷酸(MEP)途徑可形成單萜類化合物的前體物質(zhì)香葉基二磷酸和倍半萜類化合物的前體物質(zhì)法呢基二磷酸，香葉基二磷酸和法呢基二磷酸在其它酶的作用下發(fā)生去磷酸化、異構(gòu)、環(huán)化和原子重排等反應(yīng)形成揮發(fā)油的各種成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆了甲羥戊酸途徑上的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰CoA

4、還原酶(HMGR)基因，該基因全長(zhǎng)1955 bp，包含66 bp的5'-UTR、329 bp的3'-UTR、poly A尾巴和1560 bp的開放閱讀框，該基因編碼519個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子質(zhì)量為55.1202 kD，理論等電點(diǎn)pI為5.37。通過(guò)在線NCBI中的Blast P比對(duì)分析表明，尾巨桉HMGR基因與青錢柳、橡膠樹、喜樹、沙梨的HMGR基因同源性均達(dá)100％。尾巨桉HMGR生物信息學(xué)分析表明：HMGR為疏水性蛋白質(zhì)；位

5、于A60、A62、A63、A83、A111、A121、A147、A149、A191、A282、A344、A363、A437、A510、A511共15個(gè)絲氨酸殘基，A144、A197、A237、A350、A362共5個(gè)蘇氨酸殘基和A120、A158、A172共3個(gè)酪氨酸殘基是蛋白質(zhì)翻譯后磷酸化修飾位點(diǎn)；存在1個(gè)信號(hào)肽，由位于A1～A25氨基酸殘組成，信號(hào)肽最有可能的酶剪切位于A25(Ser)殘基與第A26(Leu)殘基之間；亞細(xì)胞定位分析

6、表明，HMGR屬于次生代謝途徑上的分泌型酶，具有一信號(hào)肽；存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域位于A5(Ⅴ)～A27(Ⅰ)殘基之間；位于A167～A176氨基酸殘基和A196～A203氨基酸殘基分別存在一個(gè)HMG-CoA結(jié)合motif：EMPVGYVQLP和TTEGCLVA，其中TTEGCLVA中的谷氨酸(Glu)在HMGR催化中起著重要作用，位于A292～A298氨基酸殘基和A441～A447氨基酸殘基分別存在一個(gè)NADP(H)結(jié)合motif:RCDG

7、HEH和GTVGGGT；分子系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，尾巨桉HMGR類聚于植物群，表明所得到的HMGR準(zhǔn)確可靠；二級(jí)結(jié)構(gòu)由47.40％的α-螺旋、15.41％的延伸鏈、7.13％的β-轉(zhuǎn)角、30.06％的無(wú)規(guī)卷曲組成。以人的HMGR為基礎(chǔ)進(jìn)行同源建模得到尾巨桉HMGR三維空間構(gòu)象呈“V”形，包含了N-結(jié)構(gòu)域、S-結(jié)構(gòu)域和L-結(jié)構(gòu)域。
　　 HMGR基因結(jié)構(gòu)分析表明，HMGR基因在基因組中存在一個(gè)大小為319 bp的內(nèi)含子，尚不明確此內(nèi)含子