洋甘菊SQS基因的克隆與鑒定及不同器官揮發(fā)油成分分析.pdf

1、洋甘菊又稱母菊，為菊科母菊屬一年生草本植物，具抗炎、抑菌、抗病毒、抗癲癇等作用。其主要活性成分為母菊薁、沒藥醇等倍半萜類物質(zhì)。角鯊烯又名鯊烯，為三萜皂苷、甾體和固醇等生物合成的前體，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、改善心功能、抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等多種生理功能，是由角鯊烯合酶（SQS）催化法尼基焦磷酸(FPP)所得。倍半萜與角鯊烯的生物合成屬于FPP代謝的兩條重要支路，角鯊烯合酶的活性可影響單萜、倍半萜和二萜等其他類異戊二烯途徑中其他支路的生物

2、合成，其中影響最大是倍半萜類的生物合成。本實(shí)驗(yàn)克隆了SQS基因cDNA全長(zhǎng)，檢測(cè)了SQS蛋白的活性，比較了洋甘菊不同器官揮發(fā)油的化學(xué)組分，為研究洋甘菊萜類合成途徑及開發(fā)利用提供分子基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.克隆了洋甘菊SQS基因cDNA全長(zhǎng)。通過簡(jiǎn)并PCR技術(shù)擴(kuò)增了洋甘菊SQS基因的部分片段，利用RACE技術(shù)從洋甘菊中首次克隆了SQS基因的cDNA全長(zhǎng)。利用生物信息學(xué)方法分析了SQS的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
　　2.體外酶活實(shí)

3、驗(yàn)檢測(cè)了洋甘菊SQS蛋白酶活。擴(kuò)增SQS基因的ORF框，連接到pET-28a(+)的表達(dá)載體中，再把重組子轉(zhuǎn)化到DE3表達(dá)菌中，構(gòu)建原核表達(dá)工程菌，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)條件的優(yōu)化，成功表達(dá)了SQS蛋白，分子量約為47KDa。GC-MS技術(shù)檢測(cè)SQS蛋白活性，結(jié)果顯示：在15.012min出現(xiàn)角鯊烯波峰，表明該蛋白具有角鯊烯合酶的活性。
　　3.利用qRT-PCR檢測(cè)了SQS基因在洋甘菊開花階段舌狀花冠、管狀花冠、莖和葉中mRNA

4、的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明：SQS基因mRNA轉(zhuǎn)錄本積累量在管狀花冠、葉、舌狀花冠和莖中呈依次遞減，管狀花冠中的表達(dá)量是舌狀花冠的11.2倍，葉中的表達(dá)量是舌狀花冠3.2倍，莖中表達(dá)量是舌狀花冠的0.7倍。
　　4.利用GC-MS技術(shù)比較了洋甘菊舌狀花冠、管狀花冠、莖和葉中的揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量。結(jié)果表明，莖、葉、舌狀花冠、管狀花冠狀花冠中分別鑒定出43、46、66、68種化學(xué)物質(zhì)。不同的器官所含揮發(fā)油的化學(xué)成分和含量有較大的差別。

5、洋甘菊管狀花冠揮發(fā)油中化學(xué)成分主要有：β-沒藥烯6.75％、7-甲氧基香豆素11.01%、ɑ-沒藥醇氧化物A12.9%和茼蒿素34.90%等；葉揮發(fā)油化學(xué)成分主要有：α-法尼烯5.52%、7-甲氧基香豆素34.72%和茼蒿素等37.18%；舌狀花冠揮發(fā)油化學(xué)成分主要有：7-甲氧基香豆素64.86%和二十四烷6.19%等；莖揮發(fā)油主要化學(xué)成分為：甘香烯3.55%和7-甲氧基香豆素24.90%。洋甘菊管狀花冠、葉、舌狀花冠和莖中揮發(fā)油相對(duì)含

6、量比例為2.31：1.66：1.60：1。倍半萜在各器官的相對(duì)含量百分比從高至低依次為：管狀花冠（25.56%），莖（21.8%），葉（15.31%），舌狀花冠（2.43%）。各器官中7-甲氧基香豆素與茼蒿素含量均較高，7-甲氧基香豆素在管狀花冠、葉、舌狀花冠和莖含量分別為：11.01%、34.72%、64.86%、24.90%；茼蒿素在管狀花冠、葉、舌狀花冠和莖含量分別為：34.90%、37.18%、2.24%、36.92%。沒藥烯（