西瓜枯萎病誘導(dǎo)表達(dá)基因的抑制消減雜交文庫構(gòu)建及其EST分析.pdf

1、本研究以國際公認(rèn)的抗西瓜枯萎病生理小種1的西瓜品種“卡紅(CalhounGray)”為材料，取接種西瓜枯萎病菌0、6、12、24、48、72h的根尖組織，提取總RNA，混合后分離純化mRNA，合成cDNA作為測驗方(Tester)，以接種蒸餾水的對照為驅(qū)動方(Driver)，構(gòu)建了受西瓜枯萎病菌脅迫響應(yīng)基因的SSH-cDNA正向文庫，分析EST序列，并利用RT-PCR技術(shù)分析抗病相關(guān)基因的表達(dá)特性。獲得的主要結(jié)果如下:
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2、、總RNA中28S條帶的亮度約為18S的兩倍以上，A260/A280值介于1.8～2.0;雙鏈cDNA呈彌散狀且分布在0.2～4 kb;酶切后片段為0.1kb～4kb，主要分布于200bp～750bp;抑制消減雜交后差異片段為150bp～800bp，集中于500bp左右;克隆效率達(dá)80％以上。構(gòu)建了包含1400余個克隆的抑制消減雜交正向cDNA文庫。
　　 2、隨機(jī)挑取部分克隆，利用reverse Northern dot-bl

3、ot進(jìn)行假陽性驗證，結(jié)果表明85％以上的克隆為陽性表達(dá)基因，達(dá)到文庫的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3、隨機(jī)挑取300個陽性克隆測序，得到259條高質(zhì)量的EST序列。經(jīng)BLAST同源性比對，167條EST有功能已知的同源序列，占全部ESTs的65.5％，有92條無相關(guān)匹配結(jié)果，功能未知。其中與抗病、防衛(wèi)相關(guān)的有64條23種，占24.7％。同源基因所代表的基因涉及編碼蛋白包括抗病信號蛋白、抗病蛋白、HR(hypersensitive reacti