應(yīng)用抑制性消減雜交克隆震顫大鼠差異表達(dá)基因.pdf

1、，K勁鴯￡5分類號(hào)塑堡單位代碼：10159學(xué)號(hào)：200321082中回瑟升夫零碩士學(xué)位論文題目：應(yīng)用抑制性消減雜交克隆震顫大鼠差異表達(dá)基因研究生：Cloningt王legenesdif億rentiallyexpressedintremorratbysuppressionsubtractiVehybridization金戈導(dǎo)師：：莖墮登：學(xué)科專業(yè)：煎墨堂論文課題起止時(shí)間：呈堅(jiān)主2=墊墮生!Q旦論文完成時(shí)間：2業(yè)主三旦，一～～～‘‘一、L一

2、蔓墅墮塑望蔓一，；應(yīng)用抑制性消減雜交克隆震顫大鼠差異表達(dá)基因目的電壓門控性鈉通道蛋白的基因變異與鈉離子通道功能異常都和癲癇的遺傳性具有密切關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以遺傳性震顫鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用抑制性消減雜交為主要技術(shù)手段，尋找震顫鼠電壓門控性鈉通道基因變異相關(guān)的差異表達(dá)基因。為篩選新的癲癇特異表達(dá)基因和基因治療奠定基礎(chǔ)。方法遺傳性震顫大鼠及正常大鼠各10只(震顫鼠為Tester，正常大鼠為Driver)，快速斷頭取腦后分離海馬組織，提取總RNA。然

3、后，進(jìn)行甲醛變性電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量?？俁NA分離純化為mRNA，用PCR—SelectcD—NAsubtraction試劑盒在反轉(zhuǎn)錄酶的作用制備震顫鼠及正常大鼠的雙鏈cD—NA。Tester和Driver的cDNA分別用同一種識(shí)別四堿基序列的限制性內(nèi)切酶RsaI消化形成平均長度大于500bp的cDNA片段。將TestercDNA均分為兩份，分別接上接頭Adaptor1和Adaptor2R接頭外側(cè)序列與第1次PCR引物序列相同，而內(nèi)側(cè)

4、序列則與第2次PCR(巢式PCR)吲物序列相同，有利于后續(xù)PCR的篩選擴(kuò)增。此外接頭上含有盯啟動(dòng)子序列及內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，為以后克隆和測(cè)序提供方便。2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定連接效率在25％以上，說明cDNA片段接頭連接效率較高。兩輪消減雜交：用過量DrivercDNA樣品分別與上述兩份連有接頭的TestercDNA樣品進(jìn)行第1次消減雜交。然后，混合上述兩份雜交樣品，同時(shí)加入新的變性DrivercDNA進(jìn)行第2次消減雜交，這一次雜交進(jìn)一步富集