利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)篩選及乙烯利誘導(dǎo)黃瓜莖尖雌性表達相關(guān)基因.pdf

1、黃瓜(Cucumis sativus L.)屬葫蘆科(Cucurbitaceae)中幼果帶刺的栽培品種,以幼嫩的果實供食用,結(jié)果能力強,產(chǎn)量高。應(yīng)振士等(1990)認為黃瓜是研究植物性別決定和性別分化的好材料。黃瓜為雌雄同株植物,性器官的敗育發(fā)生在形態(tài)發(fā)生晚期,單性花的性別決定取決于植物個體的基因型與環(huán)境條件的相互作用。
　　 影響黃瓜性別的基因中起主要作用的是m、F和A基因。但不論作用多強,其表達也要受到其他基因和環(huán)境的影響。

2、黃瓜的性別決定對植物生長調(diào)節(jié)劑處理非常敏感,適宜的植物生長調(diào)節(jié)劑處理可使黃瓜的性別向不同的方向轉(zhuǎn)化。乙烯利(或乙烯)可使植株雌性化,乙烯的作用看來是明確而且關(guān)鍵性的,其作用位點是莖尖。并且許多因素可以影響植物生長調(diào)節(jié)劑對性別的作用,如處理時的發(fā)育時期,植物生長調(diào)節(jié)劑處理的濃度和處理次數(shù),環(huán)境因素(特別是溫度和光周期)等。
　　 雖然利用遺傳分析已對黃瓜的性別決定遺傳有一些了解,但有關(guān)性別基因作用的機理、細胞遺傳以及植物激素(尤其

3、是乙烯)是怎樣參與調(diào)控性別決定過程等方面的研究尚少報道。因此,要用分子生物學(xué)的方法分離出有關(guān)的基因,仍需大量的工作。
　　 本研究以黃瓜雄性系品種D06103為試材,利用150mg/L的乙烯利處理黃瓜兩葉一心時期的莖尖,以處理組莖尖為Tester,對照組莖尖為Driver,利用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建性別決定時期乙烯利處理的黃瓜莖尖cDNA文庫,篩選乙烯利誘導(dǎo)黃瓜雌性表達相關(guān)基因,并對文庫篩選出的11個基因進行了表達分析。

4、在此基礎(chǔ)上利用電子克隆技術(shù)克隆出3個黃瓜雌性表達相關(guān)基因的cDNA全長,并分別對其組織特異性表達進行了研究。
　　 試驗結(jié)果如下:
　　 1.確立了外源激素乙烯利對黃瓜兩葉一心時期的誘雌效果最佳的濃度為150mg/L,并且不同濃度的乙烯利對黃瓜第一雌花節(jié)位影響不顯著,但是對植株上雌花占總花數(shù)的百分比影響差異顯著。乙烯利誘導(dǎo)后黃瓜雌、雄花芽掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),雌花中的雄蕊發(fā)育后期受到抑制,而雄花發(fā)育正常。
　　 2.

5、構(gòu)建乙烯利誘導(dǎo)后黃瓜莖尖的SSH文庫,經(jīng)過反向Northern雜交后得到120個陽性克隆,利用CAP3軟件進行聚類和拼接,獲得乙烯利誘導(dǎo)后特異增強表達的UniESTs103個,其中包括14個Contigs和89個Singlets。在GenBank上進行同源比對后,發(fā)現(xiàn)其中有99條可以找到已知的同源序列,占全部EST的96.1％;4條沒有顯著匹配結(jié)果,占全部EST的3.9％。有73條ESTs功能已知,占全部ESTs的73.7％;26條功能

6、未知,占全部EST的26.3％。利用GeneOntology進行功能分類發(fā)現(xiàn)除未知功能外,很多基因涉及新陳代謝(尤其是光合作用)還有蛋白質(zhì)合成、細胞間通訊和能量代謝等過程。
　　 3.對文庫篩選得到的部分基因進行組織特異性表達分析,根據(jù)分析結(jié)果推測乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因CS-EBF1、胞內(nèi)甲基化作用相關(guān)基因CS-SAHH、參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因CS-PPR以及光合作用相關(guān)基因CS-RBCL和CS-CAB8與黃瓜乙烯利誘導(dǎo)后的雌性表達密

7、切相關(guān)。
　　 4.克隆了黃瓜CS-EBF1基因,并對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測。基因編碼區(qū)全長為1964bp,編碼640個氨基酸。該基因與擬南芥中的EBF1基因有67％的核苷酸序列相似性。蛋白含有部分F-box保守區(qū)域和LRRs區(qū)。CS-EBF1基因的表達分析表明在根、莖、葉、莖尖都受到乙烯利的誘導(dǎo)表達,并且在雌花芽中表達強于雄花芽,推測其與黃瓜雌花發(fā)育密切相關(guān)。
　　 5.克隆了瓜CS-SAHH基因,并對其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行

8、了預(yù)測?；蚓幋a區(qū)全長1545bp,編碼485個氨基酸。黃瓜CS-SAHH氨基酸序列與苜蓿的同源性為63％。該基因編碼的蛋白有兩個S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能區(qū)?；虮磉_分析表明,其在乙烯利誘導(dǎo)的黃瓜莖尖中表達增強,而在雄花的雄蕊中表達弱于雌花的各個部位。推測甲基化修飾作用參與黃瓜雄蕊的發(fā)育。
　　 6.利用生物信息學(xué)手段克隆了黃瓜CS-PO基因,該基因開放讀碼區(qū)為791bp,編碼237個氨基酸。該蛋白可能存在2個凝血