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文檔簡介
1、福建醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文1.應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)篩選、分離、克隆急性白血病復(fù)發(fā)相關(guān)基因;2.聚合酶鏈轉(zhuǎn)化-阻斷PCR消減法:一種新的篩選差異表達(dá)基因方法的建立和驗(yàn)證姓名:陳鑫基申請學(xué)位級別:博士專業(yè):內(nèi)科學(xué)(血液病學(xué))指導(dǎo)教師:胡建達(dá)20090301P C R 消減后,二者之間共有基因( B - a c t i n ) 和差異表達(dá)基因( m d r —1 ) 表達(dá)的變化,驗(yàn)證該方法對t e s t e r 模板中差異表達(dá)基因
2、的選擇性擴(kuò)增作用。結(jié)果1 .成功構(gòu)建消減效率高的一對來自同一個體復(fù)發(fā)與初治時(shí)的急性淋巴細(xì)胞白血病差異表達(dá)基因的c D N A 文庫。2 .成功測序3 4 份陽性克隆,其中2 0個片段為未知序列E S T ,其中1 3 個E S T 片段經(jīng)斑點(diǎn)雜交證實(shí)為差異表達(dá)基因。提示這些片段可能來自1 3 個新基因,這些新基因可能與復(fù)發(fā)及耐藥相關(guān)。已在美國N I H 的基因庫G e n B a n k 登錄注冊7 個E S T 片段。注冊號分別為:C
3、 B 4 1 2 2 5 9 —C B 4 1 2 2 6 5 。3 .挑取其中一個E S T ( s s h 3 6 9 - 2 4 ) ,應(yīng)用電子克隆結(jié)合R T - P C R 方法進(jìn)行c D N A 的克隆,得到兩個新的真核細(xì)胞翻譯起始因子4 E ( e u k a r y o t i c i n i t i a t i o nf a c t o r4 E ,e I F 4 E ) 剪接異構(gòu)體全長c D N A ,分別命名為真核細(xì)
4、胞翻譯起始因子4 E 剪接異構(gòu)體1 ( s p l i c i n gv a r i a n t lo fe l F 4 E ) 和真核細(xì)胞翻譯起始因子4 E 剪接異構(gòu)體2 ( s p l i c i n gv a r i a n t 2o fe l F 4 E ) 。開放閱讀框( o p e n r e a d i n g f r a m e ,O R F ) 分析結(jié)果表明二者編碼的蛋白產(chǎn)物與e I F 4 E蛋白有所不同。4 .半定
5、量R T - P C R 方法檢測e l F 4 E 剪接異構(gòu)體2 在正常人和白血病病人中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)正常人與急淋病人之問的表達(dá)無顯著性差異;急單病人( 初治和復(fù)發(fā)) 表達(dá)量低于正常人和急淋病人,差異具有顯著性( /2 < 0 .0 5 ) 。5 .阻斷P C R 對短引物制備的t e s t e r 模板具有選擇性擴(kuò)增作用;對于長度不同的同源D N A 模板,聚合酶鏈反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)短模板向長模板的有效轉(zhuǎn)化。6 .經(jīng)過聚合酶鏈轉(zhuǎn)
6、化一阻斷P C R 消減后T e s t e r 和D r i v e r 共同表達(dá)的B - a c t i n 的表達(dá)量較對照組( 未轉(zhuǎn)化組) 減少約1 0 個循環(huán),而差異表達(dá)基因m d r - 1 的表達(dá)量無明顯變化。結(jié)論1 .成功構(gòu)建消減效率高的一對來自同一個體復(fù)發(fā)與初治時(shí)的急性淋巴細(xì)胞白血病差異表達(dá)基因的c D N A 文庫。2 .獲得兩個新的e I F 4 E 剪接異構(gòu)體全長e D N A ,二者編碼的蛋白產(chǎn)物與e I F 4
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