應用抑制消減雜交技術(SSH)篩選癲癇的相關基因.pdf

1、目的:
　　 癲癇(epilepsy)是以腦神經(jīng)元異常放電引起的慢性反復發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。顳葉癲癇（TemporalLobeEpilepsy，TLE）占難治性癲癇(refractoryepilepsy，RE)患者的60％～70％，是局限性癲癇的代表，主要病理表現(xiàn)為海馬、杏仁核、嗅皮層及正中丘腦核團內(nèi)選擇性神經(jīng)元脫失、膠質(zhì)細胞增生、苔蘚纖維出芽以及特異性突觸重塑。
　　 近年來應用原位雜交

2、法、免疫組化法及cDNA微陣列等方法研究發(fā)現(xiàn)了一些與癲癇相關的異常基因表達，這些基因參與免疫應答、炎癥、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及細胞周期調(diào)控。盡管傳統(tǒng)雜交方法在某些研究中成功運用，但是不適合鑒別稀有基因。與傳統(tǒng)雜交方法不同，抑制消減雜交技術(suppressionsubtractivehybridization，SSH)是一種功能強大的鑒別稀有信息的方法，并且擁有快速、靈敏、高效、假陽性率低和可重復性的特點。
　　 本實驗

3、應用SSH技術對氯化鋰—匹魯卡品致癇大鼠這一公認的顳葉癲癇大鼠模型的海馬組織構建差異表達基因的正向消減cDNA文庫，尋找與癲癇發(fā)作有關的新的基因片段，以進一步探索顳葉癲癇的發(fā)病機制和相關基因的特征。
　　 方法:
　　 1.建立顳葉癲癇大鼠模型，成年健康雄性Wistar大鼠14只，體質(zhì)量200～250g，山東大學實驗動物中心提供。分為癲癇組8只，對照組6只。癲癇組給予氯化鋰127mg/kg腹腔注射，24h后腹腔注射匹魯卡

4、品30mg/kg，在匹魯卡品注射前30min給予阿托品1mg/kg腹腔注射，以拮抗外周膽堿能效應。出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)90min后給予安定10mg/kg腹腔注射終止發(fā)作。對照組給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射。
　　 2.提取組織RNA并用于SSH分離差異表達基因的cDNA片段，將其與T載體進行T/A連接構建文庫，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行文庫擴增后，隨機挑取個60個白色克隆用菌落PCR法篩選差異基因克隆，并進行測序分析。
　　

5、 3.測序結果通過BLAST序列對比工具進行同源性比較，并應用GeneOntology(GO)對基因進行功能性分類。
　　 結果:
　　 1.顳葉癲癇大鼠模型:匹魯卡品致癇后按照Racine大鼠癲癇發(fā)作分級標準判定其發(fā)作程度，發(fā)作達到3～5級的大鼠視為誘導成功，表現(xiàn)為點頭、面部肌肉抽搐、肢體陣攣和跌倒等。癲癇組有兩只死亡，在實驗組中剔除。對照組無死亡。
　　 2.對鑒定出的基因進行功能分類，發(fā)現(xiàn)這些基因與細胞生