利用抑制差減雜交(SSH)技術(shù)研究脂多糖誘導(dǎo)的點(diǎn)帶石斑魚(yú)功能基因.pdf

1、本研究首先以熱酚水抽提法提取致病溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)強(qiáng)毒株HN08155和弱毒株HN08152的粗脂多糖(Lipopolysaccharidcs，LPS)；以弱毒株HN08152和大腸桿菌(Escherichia coli)LPS作對(duì)照，將不同濃度的溶藻弧菌強(qiáng)毒株HN08155粗LPS通過(guò)腹腔注射法接種點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinephelus malabaricus)，通過(guò)測(cè)定死亡率和各組石斑魚(yú)血液中白細(xì)胞吞噬

2、活性、血清抗菌活性、溶菌活性和酚氧化酶活性等免疫指標(biāo)，研究該LPS對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)的毒性和免疫保護(hù)力。結(jié)果表明，溶藻弧菌強(qiáng)毒株和弱毒株粗LPS均對(duì)石斑魚(yú)具有比較強(qiáng)的毒性，溶藻弧菌LPS對(duì)石斑魚(yú)的免疫保護(hù)力隨LPS濃度的增高而增強(qiáng)，高純度的大腸桿菌LPS對(duì)石斑魚(yú)的免疫保護(hù)效果要優(yōu)于溶藻弧菌粗LPS。
　　 選用低濃度、高純度大腸桿菌LPS刺激的石斑魚(yú)頭腎細(xì)胞cDNA為T(mén)ester組，注射PBS的對(duì)照組石斑魚(yú)頭腎細(xì)胞cDNA為Drive

3、r組，進(jìn)行抑制差減雜交(SuppressionSubtraetive Hybridization，SSH)，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序并經(jīng)生物信息學(xué)分析，共獲得13種不同功能基因的克隆。其中免疫相關(guān)功能基因干擾素調(diào)節(jié)因子-2(irf2)、T-Complex protein 1-theta(tcp-1-theta)、40S核糖體蛋白S8(rpS8)和空泡蛋白分選(vps8)基因共4種；氧運(yùn)輸功能基因血紅素-α鏈(alpha-ch

4、ain Hb)、血紅素-β鏈(beta-chain Hb)和鐵蛋白重鏈(fhc)3種；轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)功能基因有蛋白質(zhì)翻譯延伸延伸因子-2(Eef2)和膠原蛋白C的內(nèi)肽酶增強(qiáng)子(pcpe)2種；代謝功能基因ct054 1種；其他功能基因有骨髓白細(xì)胞分化蛋白家族(Myeloid leukemia differentiation proteinhomologue)基因、斑馬魚(yú)基因庫(kù)中編號(hào)為73290基因(zgc：73290)和未命名蛋白基因3