斜帶石斑魚白細(xì)胞介素-1β基因的克隆鑒定和功能研究.pdf

1、本研究結(jié)果如下： 1.本研究克隆的斜帶石斑魚IL-1β基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，其cDNA序列由1，364個(gè)堿基組成，含有一個(gè)長(zhǎng)765 bp的開放讀碼框，編碼一段含254個(gè)氨基酸的前體蛋白。與其他魚類IL-1β相似，斜帶石斑魚IL-1β基因所編碼的蛋白擁有12個(gè)β-折疊鏈，IL-1家族標(biāo)識(shí)序列和3’非編碼區(qū)的mRNA不穩(wěn)定基序，但缺少了分泌蛋白的信號(hào)肽序列以及哺乳動(dòng)物中保守的IL-1β轉(zhuǎn)換酶切割位點(diǎn)。與其他脊椎動(dòng)物IL-

2、1β核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚IL-1β與鱸形目和鰈形目IL-1β親緣關(guān)系最近，與哺乳動(dòng)物進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。 2.斜帶石斑魚IL-1β基因在所檢測(cè)的神經(jīng)組織和外周組織中廣泛表達(dá)。除前腸、脂肪和卵巢外的外周組織都能表達(dá)IL-1β mRNA，其中以脾臟、頭腎、腎臟、肝臟、心臟和鰓的IL-1β基因表達(dá)量較高，其次是紅肌、后腸、胸腺和胃。在端腦、下丘腦、中腦．丘腦、小腦和垂體等神經(jīng)組織中均能檢測(cè)到IL-1β

3、mRNA的表達(dá)。這些證據(jù)顯示，斜帶石斑魚IL-1β可能參與體內(nèi)局部和全身的信號(hào)傳遞。 使用不同的分裂素(雙鏈RNA類似物，Poly I：C；植物凝集素，PHA；伴刀豆球蛋白，ConA；脂多糖，LPS)刺激斜帶石斑魚外周血白細(xì)胞，都能誘導(dǎo)IL-1β基因的表達(dá)，并以Poly I：C和LPS效果最為顯著，但Poly I：C和LPS的作用效果并不相同。上述研究結(jié)果說(shuō)明IL1β基因可能通過(guò)與哺乳動(dòng)物類似的途徑參與抵御感染的免疫應(yīng)答。

4、 本研究首次報(bào)道魚類腦部不同分區(qū)組織的IL-1 β分布情況，及分裂素PHA，ConA和Poly I：C對(duì)魚類IL-1β基因表達(dá)的影響。 3.利用大腸桿菌系統(tǒng)重組表達(dá)斜帶石斑魚IL-1β成熟肽。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)的時(shí)間、溫度和IPTG濃度的優(yōu)化，在30℃，0.5 mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后獲得高產(chǎn)量，可溶性的斜帶石斑魚重組IL-1β蛋白。以抗組氨酸標(biāo)簽的單抗為一抗的Western雜交鑒定純化和脫鹽后的重組蛋白確為斜帶石斑魚IL-1β蛋白

5、。 利用該重組蛋白對(duì)新西蘭雄兔進(jìn)行免疫，經(jīng)ELIJSA和Westem雜交鑒定，所制備的斜帶石斑魚IL-1β多克隆抗血清效價(jià)較高，并具有一定的特異性。 4.通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)斜帶石斑魚重組IL-1β蛋白的生物活性，發(fā)現(xiàn)10ng／ml以上濃度的重組蛋白已經(jīng)能夠有效刺激斜帶石斑魚頭腎細(xì)胞的增殖，并存在劑量依存效應(yīng)。通過(guò)離體孵育和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在斜帶石斑魚外周血白細(xì)胞還是頭腎細(xì)胞中，10 ng／ml重組蛋白都能

6、比lO gg／ml LPS更強(qiáng)力的誘導(dǎo)下游炎癥因子COX-2和IL-1β本身mRNA的表達(dá)。 結(jié)果說(shuō)明，原核系統(tǒng)表達(dá)的斜帶石斑魚IL-1β重組蛋白能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞活化增殖，以及啟動(dòng)和調(diào)節(jié)下游基因COX-2和IL-1β基因表達(dá)的生物學(xué)活性，有望作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，提高魚類抗病能力。 5.采用RT-PCR．技術(shù)，檢測(cè)斜帶石斑魚IL-1β重組蛋白和MAPK信號(hào)通路抑制劑共刺激孵育對(duì)斜帶石斑魚頭。腎細(xì)胞COX-2和IL