柑橘CBF類似基因低溫脅迫下的表達(dá)與分析.pdf

1、CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物低溫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用,CBF基因的誘導(dǎo)表達(dá)可以改善許多植物的低溫和干旱耐受性。為了揭示柑橘CBF抗寒分子調(diào)控機(jī)制,本研究以枳殼,臍橙,柚和粗檸檬為主要實驗材料,研究了枳CBF及相關(guān)基因在根莖葉等組織器官中低溫和外源ABA條件下表達(dá)情況,橙CBF及相關(guān)基因在低溫、高鹽和外源.ABA等脅迫條件下的表達(dá)情況。為了進(jìn)一步獲得柑橘CBF基因組DNA及編碼蛋白質(zhì)等信息,分別從四種柑橘中分離了PtCBF、CsCBF、CgCB

2、F’和CICBF基因組DNA序列及其啟動子序列,即pPtCBF、pCsCBF、pCgCBF和pCJCBF,并進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)比較分析及CBF啟動子功能鑒定。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將柑橘CBF啟動子導(dǎo)入煙草中,通過條件處理,檢測GFP報告基因的表達(dá)活性。主要結(jié)果如下:
　　 1.柑橘CBF及相關(guān)基因在脅迫條件下的表達(dá)分析結(jié)果表明,柑橘CBF能夠響應(yīng)低溫、高鹽及ABA脅迫,受上述脅迫調(diào)控表達(dá)。然而,枳PtCBF與臍橙CsCBF在功能上

3、可能存在一定差異。枳PtCBF受低溫上調(diào)表達(dá),而臍橙CsCBF受低溫脅迫顯著下調(diào),兩者均受外源ABA上調(diào)表達(dá)。此外,枳PtCBF’可能是枳MYBl5的下游靶基因,枳PtCBF或MYB15與枳冷調(diào)節(jié)基因CORc410之間可能沒有直接關(guān)系；臍橙CsCBF在高鹽脅迫下受臍橙.MYB15轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),ABA條件下則調(diào)控臍橙CORc410基因的表達(dá),臍橙MYB15與臍橙冷調(diào)節(jié)基因CORc410之間也可能存在聯(lián)系。
　　 2.柑橘CBF基因組D

4、NA的分離和生物信息學(xué)分析柑橘CBF基因組DNA內(nèi)部不含內(nèi)含子；AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和CBF特征序列在柑橘CBF氨基酸序列中高度保守；CBF蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析表明,其AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)部含有3個反向平行的β-折疊和1個α-螺旋結(jié)構(gòu),他們可能直接參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；同時推測,柑橘CBF作為轉(zhuǎn)錄因子極可能定位于細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。枳PtCBF,橙CsCBF,柚CgCBF及粗檸檬CjCBF在核苷酸水平和氨基酸水平上,

5、枳PtCBF與其他三種柑橘CBF之間沒有顯著差異。
　　 3.柑橘CBF基因啟動子序列的分離及元件分析序列比對分析發(fā)現(xiàn),柑橘CBF啟動子序列一致性高達(dá)90％以上。柑橘CBF基因轉(zhuǎn)錄起始位點可能位于翻譯起始密碼子上游185 bp處。PLACE和PlantCARE分析發(fā)現(xiàn),四種柑橘CBF啟動子序列中含有多種常見脅迫相關(guān)順式作用元件,如ABRE,MYBR,MYCR,G-Box,W-Box以及生物鐘響應(yīng)元件等。然而,只在枳pPtCBF中

6、檢測到LTRE元件,其他三種柑橘CBF啟動子中沒有檢測到該識別序列,但預(yù)測了一個CBFHV類似元件。此外,粗檸檬CBF啟動子分離過程中獲得長短兩條序列。對柑橘CBF啟動子各序列進(jìn)行剪接,可以將其劃分為2個保守區(qū)域和1個相對連續(xù)的可變區(qū)域,在可變區(qū)內(nèi)存在大量正向重復(fù)和反向互補(bǔ)重復(fù)等特殊序列。
　　 4.柑橘CBF基因啟動子的煙草轉(zhuǎn)化及初步鑒定在煙草轉(zhuǎn)基因過程中,發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌污染嚴(yán)重,同時在轉(zhuǎn)基因檢測中,GFP污染普遍。經(jīng)過PCR