柑橘CBF類似基因的克隆與分析.pdf

1、柑橘是亞熱帶水果，在栽培范圍上受到低溫的限制。周期性凍害往往導(dǎo)致柑橘果實(shí)產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，甚至樹(shù)體死亡，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，防治凍害就成為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展和提高其經(jīng)濟(jì)效益的一個(gè)重要問(wèn)題。解決這一問(wèn)題的主要方法途徑是加強(qiáng)田間管理和選育抗寒新品種，而后者是根本途徑。近年來(lái)，采用基因工程手段培育新品種已成為農(nóng)作物育種的一種趨勢(shì)。植物抗寒性屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，是多基因協(xié)同作用的結(jié)果。采用單一基因轉(zhuǎn)化植物，雖能在一定程度上提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)

2、低溫的抗性，但實(shí)際效果往往不理想。CBF是調(diào)控一系列植物冷馴化相關(guān)基因表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在低溫誘導(dǎo)下迅速合成，與相應(yīng)順式作用元件CRT/DRE結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而合成糖類、脯氨酸和膜蛋白等物質(zhì)，提高植物的抗寒性?；蜣D(zhuǎn)化試驗(yàn)證明，CBF基因在擬南芥和油菜等多種植物中超量表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的耐性均顯著增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)為利用基因工程手段提高植物耐寒性提供了一條新途徑。 本研究從抗凍性明顯不同的枳殼、臍橙和檸檬中分離出CBF

3、同源基因的AP2核心區(qū)段，初步確證了柑橘中同樣存在CBF介導(dǎo)的冷馴化過(guò)程。進(jìn)一步從枳殼這一抗寒性最強(qiáng)的柑橘種類中克隆出CBF基因的全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，為今后利用這些基因提高柑橘抗寒性奠定基礎(chǔ)。主要的試驗(yàn)結(jié)果如下： 1．探索柑橘葉片總RNA提取方法，先后嘗試了異硫氰酸胍法、Trizol試劑法和熱酚法，最終確定采用熱酚法，并用LiC1沉淀的方法從柑橘葉片中提取的RNA最完整，DNA、蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)含量最少。

4、 2．參考擬南芥等其它物種中CBF蛋白的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了四條簡(jiǎn)并引物，并篩選出最優(yōu)的一對(duì)引物，用于RT—PCR擴(kuò)增。結(jié)果從枳殼、臍橙和檸檬中各分離出一個(gè)CBF同源基因AP2核心區(qū)段（柑橘CBFa基因）。并從枳殼中分離出另一個(gè)不同的CBF基因AP2核心區(qū)段（枳殼CBF1基因）。利用BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)CBF片段與其它物種CBF蛋白間具有很高的同源性。臍橙和檸檬CBFa基因AP2區(qū)段的序列完全一樣，而與枳殼CBFa基因AP2

5、區(qū)段存在數(shù)個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異和一個(gè)氨基酸殘基的差異。 3．依據(jù)所分離的兩個(gè)枳殼CBF基因AP2區(qū)段的核苷酸序列，設(shè)計(jì)分別指向5’和3’端的嵌套特異引物，參考SMART RACE技術(shù)，采用巢式PCR分別擴(kuò)增枳殼CBFa和CBF1基因的5’和3’端。測(cè)序驗(yàn)證后，在5’—UTR和3’—UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)基因，或者采用酶切拼接法獲得全長(zhǎng)基因。結(jié)果成功獲得了枳殼CBFa和CBF1基因的全長(zhǎng)cDNA。 4．利用Ge

6、neBank、ExPASy、EMBOSS和Jalview等數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件對(duì)所克隆的兩個(gè)枳殼CBF基因全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枳殼CBFa和CBFl基因都具有CBF特征序列、核定位信號(hào)序列、保守的AP2 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和潛在的酸性結(jié)構(gòu)域。這是所有物種CBF因子的典型結(jié)構(gòu)特征。此外，它們還具有一些其它的特征位點(diǎn)，包括酰基化、酪胺酸硫化和Amidation位點(diǎn)以及一些蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，如蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和酪蛋白激酶